寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒三重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

本研究旨在建立寨卡病毒(ZIKV virus,ZIKV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)以及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)三种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术。选用ZIKV的NS1基因、DENV的NS5蛋白基因以及CHIKV的E1蛋白基因作为靶标区域设计三组特异性引物探针,建立三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用ZIKV、DENV、CHIKV病毒体外转录RNA和病毒细胞培养物对该方法的灵敏性、特异性、重复性等方面进行评价,最后临床样本以及模拟标本验证。结果显示:三重实时荧光定量RT-PCR检测方法扩增效率均可达到90%以上,三种病毒体外转录RNA最低检测限均低于15拷贝/PCR,病毒培养物最低检出限均低于10PFU/mL且与单重检测方法无明显差异。与其他病毒无交叉反应,变异系数均在2%以内。临床标本及模拟标本检出率均可达95%以上。本研究建立的检测寨卡病毒、登革病毒以及基孔肯雅病毒的三重实时荧光RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于寨卡病毒病等相关临床标本的检测。     

基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法研究

为了便于新发或罕见病毒性传染病的筛查检测,本研究利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒—发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒—登革病毒为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法。研究中通过梯度稀释的RNA病毒模拟样本中可能存在的不同丰度的病原体,样本核酸依次加工成单链cDNA、双链cDNA、T4DNA连接酶处理后的双链cDNA以及添加外源辅助RNA后合成并连接的双链cDNA形式,然后进行Phi29DNA聚合酶等温扩增,使用荧光定量PCR方法比较各种方法对RNA病毒核酸扩增的影响。结果显示,对于不同类型的RNA病毒模拟标本,多重置换扩增对于单链及双链cDNA的扩增效果有限,而双链cDNA经DNA连接酶处理后的扩增能达到6×103倍;在cDNA合成过程中加入外源辅助RNA,模拟样本中病毒基因组的扩增可达2×105倍,尤其是对含有低丰度病原体的模拟样本扩增效果的改善更为明显。本研究摸索建立了基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法,能够对样本中低丰度RNA病毒基因组实现有效扩增,可满足开展多种病原体筛查检测的需求。     

寨卡病毒及其疫苗研究

寨卡病毒与黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒等都属于蚊媒传播的黄病毒属病毒。寨卡病毒分离于1947年,但由于分布区域有限,所致寨卡热症状较轻,很长一段时间并没有引起太多的关注。最近一些年,特别是2015年后,巴西的寨卡疫情暴发及其与新生儿小头畸形的关联,引起了全球越来越多的关注。疫苗是应对寨卡疫情的重要手段,目前全球有30余个机构在进行寨卡病毒疫苗的研发。本文综述了寨卡病毒的生物学、流行病学、临床特征以及当前不同类型寨卡病毒疫苗研发现状,同时对其他几种黄病毒属病毒批准和临床阶段疫苗情况进行了概述,以为相关研究人员提供参考。     

用于高通量测序未知病原体分析的样本预处理方法及扩增方案概述

2005年以来,二代测序平台和测序技术越来越普及,被广泛用于新病毒和未知病原体的发现,从未经培养的复杂样本中筛查病毒类病原体需要更多的前期处理措施。我们围绕高通量测序所涉及到的测序样本预处理方法和扩增方法做简要总结:样品类型分为无菌样本和开放样本;病原体类型包括病毒、细菌、真菌等;背景核酸去除的常用方法包括物理分离、核酸酶消化和几种r RNA去除的方法;常用的微量样本非特异性扩增方法包括随机引物PCR、SISPA技术、锚定随机引物PCR、RCA技术、MDA技术和NASBA技术。     

Emaravirus属新病毒:中国枣树花叶伴随病毒全基因组测序

[目的]2016年以来,新疆阿克苏等地区出现了一种新的枣树病害,严重威胁当地及周边红枣产业。本研究旨在鉴定引起此次病害的病原,探究病原体的传播方式,为生物防治策略的开发提供研究基础。[方法]对发病植株进行小RNA测序以鉴定病原体;对新鉴定的病毒,通过RNAseq和反转录PCR获取病毒全序列;体外表达重组的病毒结构蛋白并制备特异性抗体,通过Western斑点杂交法在发病植株中确证病毒蛋白;收集发病区域的媒介昆虫,通过反转录PCR在昆虫体内检测病毒的基因组,鉴定可能的传毒介体。[结果]本研究鉴定一种新的欧洲山梣环斑病毒属病毒为新疆新发枣树病害可能的病原体,命名为中国枣树花叶伴随病毒(Chinese date mosaic-associated virus,CDMaV)。CDMaV是一种多分段单链RNA病毒,基因组由5条负义RNA组成;RNA1-RNA5大小分别为7160、2224、1230、1493、971 nt,每条基因组RNA的互补链包含一个开放阅读框,共编码5个蛋白,依次为依赖RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白、核衣壳蛋白和两个未知功能蛋白。在枣树寄生虫枣瘿螨体内扩增到病毒序列,表明该病毒可能以枣瘿螨为介体在枣树间进行传播。[结论]本研究为新疆新发枣树病害鉴定了相关病原体CDMaV,完成CDMaV全基因组测序,并鉴定枣瘿螨为可能的传毒介体。鉴定病原体和传播介体是建立病害防治方法的必要基础。     

黄病毒基因组非编码区的结构与功能研究进展

黄病毒科黄病毒属是由一组含单股正链RNA基因组的囊膜病毒组成,包括登革病毒、流行性乙型脑炎病毒、寨卡病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒等,经由虫媒传播,可引起人类和动物的严重虫媒病毒病。黄病毒基因组由1个开放阅读框、5′非编码区和3′非编码区三部分组成。5′和3′非编码区含有病毒基因组复制所必需的启动元件;高度结构化的3′非编码区负责黄病毒亚基因组RNA的产生,从而有助于病毒逃避宿主免疫反应;此外3′非编码区还可作为疫苗研究的靶标。鉴于非编码区在黄病毒的蛋白翻译、基因组复制和免疫调节中发挥的重要作用,本文就黄病毒基因组非编码区的结构与功能最新研究进展作一简要综述。     

登革病毒基因组核苷酸序列与血清学分型的相关性研究

为证明登革病毒基因组核苷酸序列与病毒血清学分型的相关性,本文以病毒全基因组和病毒5′末端非编码区,E蛋白,NS1蛋白和3′末端非编码区四个基因区段分别进行病毒型间比较.比较结果表明病毒全基因组和病毒的各个基因区段均明显分为相互独立的4个分支,与病毒血清型分型完全吻合,不存在型间重组的现象.文章进一步分析了各型登革病毒型内核酸序列的相似性和型内病毒重组的可能性.     

登革病毒基因组核苷酸序列与血清学分型的相关性研究

为证明登革病毒基因组核苷酸序列与病毒血清学分型的相关性,本文以病毒全基因组和病毒5'末 编码区,E蛋白,NS1蛋白和3'末端非编码区四个基因区段分别进行病毒型间比较。比较结果表明病毒全基因组和病毒的各个基因区段均明显分为相互独立的4个分支,与病毒血清型分型完全吻合,不存在型间重组的现象。文章进一步分析了各型登革病毒型内核酸序列的相似性和型内病毒重组的可能性。     

线粒体基因组的高通量测序策略

综述了高通量测序技术在线粒体全基因组测序中的策略,利用该技术对线粒体全基因组进行序列测定的方法可以归纳为两种,一种是先对目标mt DNA进行富集,包括mt DNA的提取纯化,目标区域PCR扩增法以及特异性探针杂交富集法(可分为基于微阵列和基于PCR探针的杂交富集法),然后对富集出的线粒体DNA进行高通量测序;另一种是先从待测样本的基因组高通量数据中挖掘出线粒体基因组序列信息,之后利用诱饵序列或者近缘物种的线粒体全基因组参考序列,使用软件MITObim对其进行组装。此外,还给出了线粒体高通量测序的优化流程图和介绍了混合样品的线粒体高通量测序策略。     

一株保存的波瓦生病毒全基因组序列测定及分析

目的：对保存的WJBC株波瓦生病毒进行全基因组序列测定和分析,阐明其与已报道毒株之间的关系。方法：将波瓦生病毒基因组编码区分11段进行RT－PCR扩增,扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化并连接pGEM－Teasy载体后转化大肠杆菌DH5ct感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后进行测序,用DNAstar软件将测序结果拼接得到全基因组序列。下载波瓦生病毒全基因组核苷酸序列,利用MEGA5．0软件构建系统进化发生树。结果与结论：WJBC株波瓦生病毒全基因组共11839nt,编码3415个氨基酸残基,病毒基因组5’端和3’端分别有111、483nt的非编码区;进化树结果显示,WJBC株波瓦生病毒与LB株波瓦生病毒的亲缘性最高,可能为同一病毒株．．     

针对多种强致病性病毒的基因芯片检测方法的建立

为了制备灵敏的可检测多种烈性病毒性病原体的基因芯片,本研究设计了针对21种烈性病毒性病原体的基因芯片检测探针,每种5条,长50 bp.并以甲病毒属的基孔肯亚病毒和黄病毒属的黄热病毒细胞培养物为检测模型,摸索了合适的病毒基因处理与扩增方法.将提取的病毒RNA先用DNase Ⅰ处理,以去除掉其中的DNA分子,然后利用病毒属特异性引物进行反转录,以引导病毒基因组的合成,从而尽可能地减少宿主细胞基因成分的干扰.进行随机PCR扩增后将扩增产物与基因芯片进行杂交,分别出现了4条基孔肯亚病毒探针信号和5条黄热病毒的探针信号,说明所设计的检测探针具有较好的特异性,可用于这2种病毒的特异性检测.这种病毒基因样品的处理和扩增方法也为此基因芯片的临床应用奠定了基础.     

牛冠状病毒BCV-Aks-01新疆南疆株全基因组序列测定及其分子特征分析

为掌握牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)BCV-Aks-01新疆南疆株的全基因组序列、分子结构特征及遗传变异情况。本研究以新疆南疆某牛场BCV-Aks-01阳性样本为基础,以GenBank中BCoV参考株设计扩增引物和测序引物,提取样本中病毒核酸,对BCV-Aks-01株进行全基因组扩增、测序、构建系统发生树及序列分析。结果表明,BCV-Aks-01新疆南疆株为BCoV,其全基因组长为30 975bp,与GenBank收录的参考株比较,核苷酸同源性高达98.8%,属于β类冠状病毒2a亚类,具有β类冠状病毒共同结构特征。首次获得BCV-Aks-01新疆南疆株全基因组序列并阐明了其基因组分子结构特征。     

利用长距离PCR扩增国内肠道病毒流行株基因组方法的建立和评价

目的:通过调查近年来我国肠道病毒EV-71型和柯萨奇病毒A16型流行株的全基因组序列,建立一种能够获得我国肠道病毒序列的通用扩增方法,为今后的手足口病流行病学分析、致病机理研究等打下基础。方法:收集我国近5年各地报道的肠道病毒流行株全基因组序列作为参考序列进行比对分析,在保守区设计通用引物,利用3'RACE、长距离PCR扩增及简并引物扩增肠道病毒全基因组序列,采用IonTorrentPGM二代测序仪对扩增产物进行深度测序,以对扩增方法进行验证和评价。结果:通过比对肠道病毒流行株序列设计了通用扩增引物,经二代测序实验获得了肠道病毒全基因组序列;以系列比例模拟混合病毒感染,该扩增方法能够同时获得2株肠道病毒的全基因组序列;能够完整地揭示肠道病毒重组情况。结论:建立了针对我国近年来肠道病毒流行株的通用全基因组扩增方法,在病毒培养液中肠道病毒的提取与扩增中显示了较高的灵敏度,能够反映混合病毒感染、重组病毒的情况。     

烟草环斑病毒的定量检测技术研究

目的:建立特异、灵敏、快速的TaqMam实时荧光定量PCR方法,用于烟草环斑病毒(TRSV)的定量检测。方法:用纳米磁珠法提取病毒RNA,构建包含烟草环斑病毒全CP序列的质粒标准品。根据CP保守序列设计特异性的引物和TaqMam荧光探针,构建标准曲线,建立TRSV的实时荧光绝对定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:建立的方法特异性好,与南芥菜花叶病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒均无交叉反应;至少能检测到767个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;同一样品试验内及试验间重复性实验的变异系数均小于3%,重复性好;检测结果准确可靠,构建的标准曲线有较好的线性关系(R2=0.997)。结论:建立的TRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法可满足口岸高通量、快速、准确的检验检疫要求。     

2018年甘肃省平凉市流行性乙型脑炎病毒的分子特征

为研究甘肃省2018年蚊虫携带流行性乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒)的分子特征,2018年7月上旬在甘肃省平凉市4个县采集蚊虫标本,采用实时荧光定量RT-PCR方法开展乙脑病毒筛查;通过高通量测序方法对乙脑病毒基因扩增阳性蚊虫标本进行深度测序研究.结果显示,本次调查在4个县共采集蚊虫1800只,均为三带喙库蚊,分36批研磨和检测.定量RT-PCR结果显示10批(27.8％)蚊虫样本呈乙脑病毒基因扩增阳性.对10批样本进行高通量测序共获得59.7 M读序,其中5.3 M(8.9％)条读序能够比对到病毒基因组数据库上,经注释属于14科15属28种病毒.在其中7批样本中检出乙脑序列共1357条,基因组覆盖度为9.5％-83.1％.系统进化分析显示甘肃省2018年采集的三带喙库蚊中乙脑病毒为基因Ⅰ型.     

库蠓源蓝舌病病毒1型的分离和初步鉴定

为监测云南边境地区虫媒库蠓蓝舌病病毒携带情况,本研究对2013年-2017年从云南6个口岸及周边地区采集到的约5 400只库蠓样本,分180组。采用荧光定量RT-PCR检测、鸡胚和细胞分离、目的基因克隆测序分析和间接免疫荧光试验等进行病毒分离与鉴定。结果显示:采集库蠓样本中有20组检出蓝舌病病毒核酸,检出率为11.11%(20/180);接种后有1份样本能导致鸡胚胚体充血出血和死亡以及BHK-21细胞呈现明显的细胞病变;RT-PCR能从感染细胞样本中扩增出蓝舌病病毒VP7基因特异性片段,且该片段序列与国外BTV-1毒株相应序列的相似性达95%~99%;间接免疫荧光试验显示分离病毒能与BTV-1抗体发生特异性结合。结果表明,云南边境地区库蠓携带有蓝舌病病毒,且为BTV-1,因此应加强对云南边境地区蓝舌病的预防与控制。     

一种基于多重PCR的人类线粒体基因组高通量测序方法

人类线粒体基因组DNA(mtDNA)是一个16569 bp的双链闭合环状DNA分子,具有母系遗传、多拷贝、高异质性及高变异率等特点,是研究人类遗传和进化上广泛使用的分子标记.近几年,高通量测序技术的出现,使得在短时间内准确测定mtDNA序列成为可能;但目前常用的高通量测序建库方法操作复杂、研究费用相对较高.基于多重PCR扩增的测序方法具有高效率、高灵敏度、低成本的特点,因而适用于大规模线粒体基因组的变异检测分析.利用73个相互重叠的扩增子通过多重PCR方法来扩增中国人的线粒体全基因组,在扩增片段两端连接特定的接头序列,然后在IlluminaHiSeq X Ten平台上进行高通量测序.对获得的测序数据分析发现,mtDNA每个位点的测序深度均达到2000×以上;当测序深度为100×时,所有样本的序列覆盖度都达到100%;数据质量适用于后续的变异检测分析.利用本研究建立的基于多重PCR的二代测序方法无需片段化即可直接上机测序,在复杂遗传病的研究中有着广泛的应用前景.     

牛乳头瘤病毒基因2型新疆南疆Aks-01流行株全基因组序列测定及其特征分析

为从分子水平了解牛乳头瘤病毒(Bovine papillomavirus,BPV)新疆南疆Aks-01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况。本研究选取新疆南疆患病牛皮肤肿瘤样物,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR法基因分型鉴定并确定其基因型,根据GenBank中BPV参考株设计扩增引物和测序引物,对Aks-01株进行全基因组扩增、测序及序列分析。序列分析表明,新疆南疆Aks-01株为BPV-2基因型,其全基因组长为7944bp,具有BPV-2基因型的结构特征,与GenBank收录的BPV-2基因型参考株核苷酸比较,同源性高达98%。与BPV-1、BPV-13的基因型参考株进化关系最近,同属Delta属。该Aks-01株为新疆南疆地区首次检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。     

网状内皮组织增生症病毒中国分离株HA9901全基因组核苷酸序列的测定与分析

以网状内皮组织增生症病毒(REV)中国分离株HA9901感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)基因组DNA作为其前病毒基因组模板, 根据已发表序列设计合成6对引物, 经PCR扩增出6段连续的、相互部分重叠的DNA片段和闭合环形前病毒两末端LTR的连接区段, 并分别连入T载体进行克隆、测序. 用DNAstar软件对测序结果进行剪辑和拼接, 完成了REV第一个中国分离株HA9901前病毒全基因组核苷酸序列. 在从截然不同的地区、不同年份、不同禽类分离到的毒株中, 将该序列与另两个毒株已完成的全基因组序列的比较表明, REV的整个基因组相对保守, 各毒株间对应基因的同源性都在92%以上. 其中, 从我国鸡体分离到的野毒株HA9901与美国鸡源分离株FA在整个基因组上的同源性均显著高于美国的鸭源SNV株.