H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的：建立H5N1禽流感病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法。方法：从GenBank中获得H5N1禽流感病毒血凝素（HA）基因序列,应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列,利用PrimerExplorerV3软件在序列保守区域设计LAMP引物,即外引物、内引物和环引物,同时以所克隆的阳性质粒为模板,对试验中的几个重要参数进行优化。结果：LAMP检测方法对H5N1禽流感病毒的灵敏度达到4～6个拷贝,其引物对于H1、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒无非特异性扩增,表现出良好的H5亚型特异性。结论：建立的H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,为快速检测禽流感病毒提供了新方法和新思路。     

LAMP技术在食源性病原微生物检测中的应用

针对常见引起食物中毒细菌的特异保守基因设计环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立食源性病原微生物的检测方法。特异性及灵敏性试验显示,LAMP法最低检出限为10-5,Real-time LAMP最低检出限为10-7,而普通PCR的检出下限仅为10-3;且LAMP全部反应在1 h内完成;LAMP反应结果可通过肉眼直接观测判定结果。LAMP快速检测常见食物中毒菌的方法初步建立,同时结合Real-time LAMP,可提供更准确的检测结果并可实现仪器在线式实时监测。     

一种用于检测恶性疟原虫的双环引物环介导等温扩增方法

目的:设计一种快速环介导等温扩增(LAMP)检测方法,用于恶性疟原虫的检测。方法:根据恶性疟原虫18S r RNA基因设计一组引物,包括外引物、内引物、环引物及第二对环引物,用于恶性疟原虫的LAMP检测。结果:双环引物LAMP检测法灵敏度可达10拷贝DNA模板/μL,可特异地检测出恶性疟原虫DNA,3次重复试验Ct值的CV小于5%,比普通加环引物LAMP检测法时间缩短10 min左右,提高了反应的检测效率。结论:建立的双环引物LAMP方法是一种高效、快速的检测方法。     

牛病毒性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立

目的:建立牛病毒性腹泻病毒(BVDv)的环介导体外等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法:根据BVDv的5'端非编码区序列,在保守区的8个位点设计LAMP特异性引物(2对特异性引物和1对环引物),对反应条件和试剂浓度进行优化,建立恒温(63.5℃)、快速(65min)的检测方法。结果:建立的方法特异性好,检测其他对照病毒均为阴性;灵敏度高,最低可检测到1个拷贝的阳性质粒,可通过观察浑浊度或加入染料后直接判定扩增结果。结论:建立了用于检测BVDv的LAMP方法,该方法简便、快速、特异性好、灵敏度高,适合基层和现场检测。     

犬细小病毒可视化LAMP检测方法的建立

目的:建立犬细小病毒(CPV)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法。方法:比对77个不同犬细小病毒全基因组数据,从中找出一段433 bp的高度保守序列作为检测对象,通过基因合成得到含该序列的质粒,制备1×10~3、1×10~2、1×10~1拷贝/μL的质粒作为标准品,并设计一套能扩增这段序列的LAMP引物。结果:首先采用实时荧光定量LAMP扩增,确定了设计的引物能够扩增质粒标准品,最低检测浓度为1×10~1拷贝/μL;然后用pH敏感指示剂中性红进行可视化LAMP扩增检测,肉眼观察到扩增反应液变为紫红色即判断为阳性,最低检测浓度同样为1×10~1拷贝/μL;随后采用实时荧光定量LAMP和可视化LAMP测试50份犬细小病毒疑似临床DNA样品,检测出阳性样品35个,与国标诊断结果完全吻合;将阳性样品扩增后测序,经比对,确定为犬细小病毒序列;对金黄色葡萄球菌、宋内志贺菌、坂崎肠杆菌、单增李斯特菌、大肠杆菌DNA进行扩增,结果均为阴性,证明了该方法的特异性。结论:建立了高度特异和灵敏的犬细小病毒可视化LAMP检测方法。     

单管可视化环介导等温扩增技术快速检测恶性疟原虫

目的:建立一种基于环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)的恶性疟原虫高灵敏可视化闭管检测方法。方法:针对恶性疟原虫核糖体DNA的序列保守区设计LAMP引物,通过优化LAMP体系中的Mg2+、甜菜碱浓度和反应温度等因素,建立环介导等温扩增法;并结合蜡封反应管对产物进行检测,检测结果可直接通过肉眼观察SYBR Green I荧光显色进行判定。结果:本方法可检测到70个拷贝/管的恶性疟原虫核酸片段,并具有高特异性,可区分检测常见的血液病毒。该法具有如下优点:1、整个反应恒温进行,无需热循环仪;2、闭管检测,极大降低了扩增产物交叉污染的风险;3、检测速度快,整个检测过程只需30 min。结论:该法的建立为恶性疟原虫的现场快速筛检提供了一种简便、高灵敏、高特异的工具。     

鸭瘟病毒LAMP可视化检测方法的建立

目的:建立一种快速、简便、特异性高的鸭瘟病毒(DPV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法。方法:根据Gen Bank中DPVUI6基因的保守序列设计一套特异性引物,并对反应条件进行优化,建立DPV的LAMP可视化检测方法。结果:建立的LAMP方法对其他鸭常见病原体无扩增反应;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;敏感性可达0.1fg,是常规PCR方法的100倍;扩增反应只须在常规水浴锅中进行,可在1 h内完成。结论:建立的DPV LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于DPV感染的快速检测。     

多重环介导等温扩增技术的研究进展

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的核酸放大扩增技术。但是,当前的LAMP技术多是在同一个体系中对单一目标物进行检测,限制了其工作效率的发挥。多重LAMP技术就是在同一反应体系中加入多组针对不同靶基因的特异性引物,从而实现对多种目标基因同时进行扩增。我们针对多重LAMP的优缺点,对其在病毒、细菌、寄生虫以及性别筛选等领域的应用做简要综述。     

转基因大豆GTS40-3-2环介导等温扩增检测方法的建立

采用转基因大豆GTS40-3-2品系特异性基因LAMP引物,建立2种转基因大豆GTS40-3-2品系特异性基因等温扩增方法:(1)实时荧光环介导等温扩增方法;(2)反应前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,根据反应后HNB的颜色变化进行判定。对两种方法进行灵敏度、特异性测试,结果表明,两种方法皆能快速、特异性检测出转基因大豆GTS40-3-2品系成分,定性检测限为0.1%。基于颜色判定的LAMP检测方法对设备要求更简单,更适用于日常检验及监管部门进行转基因成分的快速检测。     

牡蛎单孢子虫环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的:建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的单孢子虫可视化检测方法。方法:根据尼氏单孢子虫的小亚基核糖体RNA保守序列,设计一套特异性LAMP引物,对反应条件如温度和试剂浓度进行优化,建立检测牡蛎单孢子虫的LAMP方法。结果:所建立的方法的敏感性可达1 fg,是常规PCR方法的100倍;全部反应可在1 h内完成;可通过肉眼观察颜色,直接判定结果;对其他牡蛎常见病原体的检测结果均为阴性。结论:建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于牡蛎单孢子虫感染的快速检测。     

环介导等温扩增技术的研究进展

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新式核酸扩增技术,它依靠一种具有链置换活性的DNA聚合酶和2对特殊设计的引物,不需要反复的温度循环和昂贵的仪器设备,在等温条件下即可高效快速地完成扩增反应,目前已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测,及动物胚胎性别的鉴定。该文总结了LAMP技术的基本原理、相对于传统核酸检测技术的优点、产物的检测方法及其临床应用,最后指出LAMP目前存在的不足以及采取的相应措施,并对其发展前景进行了展望。     

用于高灵敏可视化检测松材线虫的闭管等温扩增法

建立了一种基于环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的松材线虫高灵敏可视化闭管检测方法。针对松材线虫核糖体DNA的序列保守区域设计LAMP引物,通过优化LAMP体系中的Mg2+、甜菜碱浓度和反应温度等因素,建立了环介导等温扩增法;并结合蜡封反应管对产物进行检测,检测结果可直接通过肉眼观察SYBR Green I荧光显色进行判定。结果表明,本方法可检测到低至10拷贝/管的松材线虫核酸片段,可对单条线虫进行检测,并且具有很高的特异性,能区分检测松材线虫与拟松材线虫。由于整个反应恒温进行,无需热循环仪;闭管检测极大地降低了扩增产物交叉污染的风险;检测速度快,整个检测过程只需40 min,为松材线虫的现场快速筛检提供了一种简便、高灵敏、高特异的工具。     

苹果牛眼果腐病菌3个致病种LAMP检测方法的建立

目的:建立引起苹果牛眼果腐病的明孢盘菌属3个致病种的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。方法:以苹果牛眼果腐病菌3个致病种为目标菌进行LAMP引物设计,根据明孢盘菌属β-tublin基因设计引物对1、2;根据真菌通用ITS序列设计引物对3,并进行LAMP试验,从中筛选出最佳引物组合,并进行最适宜反应温度的筛选。结果和结论:经验证得出,由ITS序列得到的引物组合3对苹果牛眼果腐病菌的3个致病种有特异性的扩增,扩增最适温度为64℃。     

核酸试纸条在检测转EPSPS基因作物中的应用

目的:建立快速、简便和特异的检测转EPSPS基因作物的方法。方法:针对转EPSPS基因作物外源基因cp4-EPSPS的8个区域,设计2对特异性引物和1对环引物,对反应体系中的MgSO4、内引物、环引物、甜菜碱、dNTP浓度和反应温度等条件分别进行优化,并用核酸试纸条对扩增产物进行检测,建立用于检测转EPSPS基因作物的环介导等温扩增方法(LAMP)。结果:用建立的LAMP方法检测转EPSPS基因作物时,在64℃恒温反应30 min,即可根据试纸条显色直接观察结果;该方法具有高度特异性,可检测到10个拷贝的EPSPS DNA。结论:LAMP方法可快速、灵敏、特异、经济地检测转EPSPS基因作物,在基层和实验室都具有良好的应用前景。     

环介导等温扩增技术的应用进展

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新式核酸扩增技术,它依靠一种具有链置换活性的DNA聚合酶与2对特殊设计的引物,在等温条件下即可高效快速地完成扩增反应。相较于传统扩增检测方法,LAMP技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点,更能在现场快速检测和基层应用中广泛推广,目前LAMP技术已广泛应用于植物病害检测、动物病害检测、食品安全检测等领域。基于此,简要介绍了LAMP技术的基本原理、反应产物的检测方法,重点阐述了LAMP技术的改进与发展,综述了近年来其在科研生产中的应用进展,并对其发展前景进行了展望,以期为LAMP技术的进一步发展提供合理的研究方向。     

用环介导等温扩增技术快速检测粪便样本中的沙门菌

目的:建立快速检测粪便样本中的沙门菌的环介导等温扩增技术(LAMP),并着重在灵敏度和特异性方面对此方法进行评价。方法:利用LAMP针对沙门菌特定基因invA(靶基因)设计的6条特异引物,通过引物特异性识别特定基因invA上的8个独立区域来快速检测沙门菌;LAMP反应过程中会产生白色沉淀焦磷酸镁,故可以通过监测浊度来判定反应结果。结果:实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在60~65℃等温条件下50 min内完成;如果在反应前添加羟基萘酚兰,蓝色阳性结果很明显区别于紫色阴性结果;LAMP的最低检出限为6.97 pg/μL,PCR为69.7pg/μL,LAMP方法的检测灵敏度是PCR的10倍,且具有良好的特异性。结论:LAMP方法用于快速检测沙门菌,具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨、灵敏度高、特异性强的特点,对非沙门菌菌株的结果呈阴性,表明引物设计有很好的特异性。对粪便样本进行检测,发现具有同样的敏感性和特异性。这表明LAMP法是潜在的和有价值的在粪便样本中直接检测沙门菌的方法,具有快速、简便、低成本的特点。LAMP法适用于快速临床诊断。     

LAMP快速检测对虾IHHNV的方法与应用

建立了一种检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis vi-rus,I HHNV)快速、灵敏的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对I HHNV非结构蛋白基因NS1序列的6个保守区域,利用Pri mer Explorer v4.0软件设计4条引物,建立了I HHNV环介导等温扩增快速检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化,并将建立的LAMP检测方法与常规PCR检测进行了比较分析。结果表明,LAMP最适反应在65℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现特征性梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果很明显区别于橙色阴性结果。LAMP方法的最低检出限为100拷贝/μL,灵敏度较常规PCR高1000倍。用建立的LAMP方法对临床发病南美白对虾样品进行了检测,结果表明建立的LAMP方法适合于对虾I HHNV的现场快速检测。     

H6亚型禽流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

建立一种快速、敏感、特异的检测H6亚型禽流感病毒(AIV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法.根据H6亚型AIV血凝素(HA)基因序列的保守区8个位点设计了6条特异性LAMP引物,以H6亚型AIV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,对反应条件和反应体系进行优化.结果表明该方法的特异性良好,对其他呼吸道病原体均无扩增反应.该方法灵敏度高,最低可检测到H6亚型AIV RNA为0.01 pg,该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的H6亚型AIV检测方法.     

不同加热方式对嗜肺军团菌环介导等温扩增检测法的影响

目的:研究不同的加热方式对嗜肺军团菌环介导等温扩增检测法的影响方法:用已知的13株嗜肺军团菌样本,采用空气浴、水浴和PCR仪同时进行环介导等温扩增,观察沉淀反应、荧光反应以及产物电泳结果。结果:水浴和PCR仪加热LAMP反应的沉淀产物较多,荧光反应较强,电泳检测结果较为明显。空气浴的3种检测结果均较弱。结论:采用水浴和PCR仪进行环介导等温扩增反应的效果较好,从仪器设备的成本及实验条件考虑,采用水浴是环介导等温扩增反应首选的加热方式。