用于高灵敏可视化检测松材线虫的闭管等温扩增法

建立了一种基于环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的松材线虫高灵敏可视化闭管检测方法。针对松材线虫核糖体DNA的序列保守区域设计LAMP引物,通过优化LAMP体系中的Mg2+、甜菜碱浓度和反应温度等因素,建立了环介导等温扩增法;并结合蜡封反应管对产物进行检测,检测结果可直接通过肉眼观察SYBR Green I荧光显色进行判定。结果表明,本方法可检测到低至10拷贝/管的松材线虫核酸片段,可对单条线虫进行检测,并且具有很高的特异性,能区分检测松材线虫与拟松材线虫。由于整个反应恒温进行,无需热循环仪;闭管检测极大地降低了扩增产物交叉污染的风险;检测速度快,整个检测过程只需40 min,为松材线虫的现场快速筛检提供了一种简便、高灵敏、高特异的工具。     

符合大肠癌早期无创分子诊断要求的粪便DNA样本贮存条件考察

目的:考察在不同温度下储存时间和反复冻融对粪便中人基因组DNA含量的影响。方法:1.将粪便样本在室温、4℃、-40℃和-70℃条件下分别放置不同时间和-40℃条件下保存并反复冻融后,使用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取得到粪便DNA,通过实时荧光定量PCR体系对人KRAS基因定量确定人基因组DNA含量,评价粪便样本不同冻存条件对其中人基因组DNA含量的影响。2.将粪便DNA样本在4℃和-40℃条件下分别放置不同时间和-40℃条件下保存并反复冻融后,评价粪便DNA样本不同冻存条件下对其中人基因组DNA含量的影响。结果:1).粪便样本常温放置2小时,其中人基因组DNA即发生明显降解(P0.01),4℃可保存3天左右,-40℃可保存4周,-70℃可保存3个月以上,粪便反复冻融第3次,其中人基因组DNA降解具有统计学意义(P0.05)。2).粪便DNA 4℃可保存3天,-40℃可保存4周,粪便DNA反复冻融第4次,其中人基因组DNA降解具有统计学意义(P0.05)。结论:符合大肠癌早期无创分子诊断要求的粪便DNA贮存条件:粪便样本室温收集后尽快保存;短期可处理的粪便样本存放在4℃条件下(3天内);暂无法处理则存于-40℃(1个月内);粪便样本长期保存在-70℃条件下,可保存3个月。     

MicroRNA定量检测方法的研究进展

MicroRNA是一类内源性的非编码小分子RNA, 通过下调蛋白编码基因的表达而对不同的细胞发育过程起到重要的调控作用。分析组织或细胞样本中microRNA的表达可为研究这类分子的生物学功能提供重要的信息。近年来, 研究者发展了许多方法检测不同的生理和病理学过程中microRNA的表达差异, 并发现microRNA的异常表达与癌症、神经紊乱和心脏疾病等的发生相关。文章系统地介绍了最新发展的microRNA定量检测方法, 详细阐述了基于探针杂交技术的Northern blotting法、微阵列芯片法、纳米金标记法、桥连同位素标记法, 以及基于扩增技术的定量PCR检测法、滚环扩增法、引物入侵法和新一代大规模高通量测序法等, 并对这些方法的优缺点进行了分析比较。     

多重环介导等温扩增技术研究进展

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)因其扩增速度快、灵敏度和特异性高、仪器要求低等优点而被广泛应用于核酸诊断领域。为充分利用LAMP技术优势、提高诊断检测的效率与可靠性、扩展其应用范围,同时节约试剂成本,近年来多重LAMP技术的研究成为一大热点。常规的LAMP扩增产物检测方法多数以聚合反应的双链DNA产物或其副产物为基础,只能判断有无扩增反应发生,而难以识别多重扩增产物的靶标来源及其特异性。为实现多重扩增产物的高特异检测,各国学者通过对该技术巧妙的改进或与其他技术相偶联,发展了一系列多重LAMP扩增检测技术。然而上述狭义的多重LAMP技术依然存在因引物间相互干扰、扩增效率存在差异而引发歧视性扩增的局限,限制了多重扩增的重数。近年研究活跃的微型扩增技术以其实现多个平行、互不干扰的小体积单重扩增的技术优势打破了这一局限,由此产生了新型的广义多重LAMP扩增技术。这些技术还具有试剂消耗少、自动化程度较高、交叉污染风险更小以及更适合对较多靶标进行现场快速检测等优势。本文分别从狭义多重LAMP的方法原理及其扩增反应体系优化、广义多重LAMP的方法原理以及多重LAMP技术在诊断检测中的应用等方面对近年来多重LAMP技术的研究进展进行了综述。