活体荧光成像对裸鼠肝癌细胞系MHCC97-H原位移植模型的动态量化分析

目的:利用生物自发光的裸鼠肝癌原位移植模型,以活体荧光成像技术对肝癌的生长和转移情况进行动态、量化分析.方法:将稳定转染了荧光素酶(luciferase)基因的人肝癌细胞株MHCC97-H-LUC细胞,移植至裸鼠肝脏包膜下,每周利用活体荧光成像系统对裸鼠体内移植瘤的生长部位和范围进行成像,测量肿瘤细胞生物发光量,动态观察肝癌细胞在裸鼠体内的肿瘤数量、生长速度和转移情况.结果:建立可稳定表达荧光素酶的人肝癌细胞株MHCC97-H-LUC并用于进行生物自发光的裸鼠原位移植模型;利用活体荧光成像系统对裸鼠体内的移植瘤成像,见发光部位由肝脏向腹腔扩散,发光量随时间呈指数级增长;病理学观察证实肿瘤细胞长.结论:利用活体荧光成像技术的动态量化分析可灵敏、准确地监测裸鼠肝癌原位移植模型中肿瘤细胞的生长及转移情况,为肿瘤发生、生长、转移机制及对抗肿瘤生长和转移的体内研究提供了科学的量化手段.     

利用萤光素酶标记的肿瘤细胞建立肝癌原位移植模型及其活体成像

目的：利用生物发光成像技术非侵入性地监测活体裸鼠原位肝癌发展过程。方法：将包含有萤火虫萤光素酶基因的pCI-neo-Luc载体转染人肝癌HepG2细胞系,筛选获得具有高萤光素酶活性的细胞克隆;利用流式细胞仪对萤光素酶表达的稳定性进行初步研究,并分析细胞的生物发光情况;持续表达萤光素酶的肿瘤细胞培养扩增后被植入裸鼠皮下,2周后以形成的异体瘤作为供体瘤,进行肝脏原位移植手术;对建立的肝癌原位移植模型,用影像学资料显示肿瘤部位,用IVIS成像系统动态监测肿瘤生长情况。结果：体外影像的结果显示,表达萤光素酶细胞的数量与发光强度呈正相关;活体成像的结果显示。成功地建立了萤光素酶标记的原位肝癌动物模型。结论：生物发光成像可以监测活体内肝癌演进过程,为抗肿瘤药物的筛选和评价提供了新的手段和工具。     

荧光素酶标的人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和PET-CT成像比较

目的利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞株BEL-7402建立裸鼠肝原位移植模型,及小鼠肝原位移植模型的生物发光和小动物PET-CT成像的比较。方法构建表达荧光素酶基因的真核表达载体并将其转入人肝癌细胞BEL-7402,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆并扩大培养。BALB/cA-nu裸鼠肝门静脉接种5×105个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像和小动物PET-CT成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达Luc的人肝癌细胞株,将其接种到裸鼠体内,活体荧光成像系统观察发现能够成瘤,小动物PET-CT影像观察发现小鼠肝脏边缘对18 F-FDG有高摄取区域。结论利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型,小动物活体成像结合小动物PET-CT技术为原位肿瘤模型的建立提供了一种新的可靠的技术,为进一步研究肝癌生长转移机制和药物开发提供了新的有用工具。     

荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用

目的利用绿色荧光小鼠和红色荧光蛋白标记肿瘤细胞,建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术。方法将小鼠B16黑色素瘤细胞接种到绿色荧光蛋白转基因小鼠皮下,建立GFP小鼠肿瘤模型。以红色荧光蛋白作为标记基因导入小鼠黑色素瘤细胞B16细胞,建立稳定表达红色荧光蛋白的细胞株。将表达红色荧光蛋白B16细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下,建立双荧光小鼠肿瘤模型。用荧光显微镜和活体荧光成像系统检测小鼠肿瘤的发生发展。结果分别建立了GFP小鼠肿瘤模型和双色荧光小鼠肿瘤模型。利用活体荧光影像仪可以观察双色荧光小鼠模型中受体绿色荧光组织和红色荧光移植肿瘤相互融合。利用荧光显微镜,可以观察到肿瘤内绿色荧光标记的来源于受体小鼠的血管和免疫细胞。经香菇多糖刺激的GFP小鼠肿瘤模型的移植瘤组织中,来源于受体小鼠绿色荧光标记的免疫细胞明显多于经生理盐水刺激的对照小鼠。结论利用绿色荧光小鼠和红色荧光RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用。     

携带荧光素酶基因肝癌细胞株的构建及在肝癌原位移植瘤模型中应用

[目的]构建稳定表达荧光素酶基因的人肝癌细胞株,建立可实时观察的肝癌原位移植瘤模型。[方法]构建含有萤光素酶基因的慢病毒载体,利用慢病毒三质粒系统磷酸钙共转染HEK 293T细胞,收集纯化病毒感染肝癌细胞SMMC7721,嘌呤霉素(puromycin)结合有限稀释法筛选稳定转导细胞株,将细胞原位注射裸鼠肝组织,建立原位肝癌动物模型。[结果]包装纯化的慢病毒悬液的滴度为8.4×106TU/m L,感染肝癌细胞后成功筛选到稳定表达的肝癌细胞株。利用该细胞株成功建立原位注射肝癌裸鼠模型,经活体荧光成像系统观察到肝癌细胞在活体动物体内的分布情况。[结论]荧光素酶肝癌细胞株的成功构建及利用该细胞株建立的原位移植瘤肝癌动物模型为肝癌的治疗研究奠定了基础。     

人宫颈癌细胞Hela移植模型肿瘤生长的荧光分析和卡尺测量的比较

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白的人宫颈癌细胞系,建立移植瘤模型并比较移植模型肿瘤生长的荧光分析和卡尺测量的优缺点。方法以Lipofectamine 2000介导chickenβ-actin-GFP-NEO转染人宫颈癌细胞Hela,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养。BALB/cA-nu裸鼠皮下接种1×10^6个发光细胞使其成瘤,利用活体荧光成像系统和游标卡尺观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达GFP的人宫颈癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤。活体荧光成像观察发现,1至3周随着肿瘤体积逐渐增大,平均荧光光子数逐渐增加;4周时随着肿瘤出现明显坏死,平均荧光光子数呈现下降趋势,而游标卡尺测量结果显示肿瘤在4至5周仍然不断的增大。结论绿色荧光蛋白能够在人宫颈癌细胞Hela中长期稳定表达,用绿色荧光蛋白标记的人宫颈癌细胞Hela建立的裸鼠肿瘤模型可以为人宫颈癌研究提供理想的实验材料,应用小动物活体成像系统能够客观定量评价活的肿瘤细胞在动物体内的生长情况,而不是肿瘤体积的变化。     

荧光素酶标记人胃癌细胞裸鼠原位移植模型的建立

目的建立荧光素酶标记人胃癌原位异种移植模型。方法将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入人胃癌MGC803细胞,建立稳定表达荧光素酶的细胞,将其接种裸鼠胃壁浆膜下,建立胃癌裸鼠原位肿瘤模型。用活体荧光成像系统检测肿瘤的发生发展,并进行小动物超声影像和病理学分析。结果裸鼠原位成瘤率为100%,活体荧光成像观察发现在接种第7天,就可以观察到肿瘤发光。21 d后肿瘤进入对数生长期,28 d后肿瘤出现明显坏死,平均荧光光子数呈现下降趋势。超声成像发现小鼠胃部有直径为8.39 mm,面积为28.92 mm2瘤块。结论荧光素酶标记可以实时监测原位异种移植人胃癌生长状况。     

人结肠腺癌细胞HCT－8绿色荧光标记肿瘤模型的建立

目的筛选表达绿色荧光蛋白基因的人的单克隆结肠腺癌细胞系,为体内监测肿瘤的早期生长建立一种新的肿瘤动物模型。方法以脂质体2000介导chicken β－acfin-GFP—NEO转染人结肠腺癌细胞HCT－8,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养。BALB／CA－nu裸鼠皮下接种1×10^6个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达GFP的人结肠腺癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤,利用活体成像系统观察了肿瘤的生长过程,肿瘤的发光随着观察时间的延长而增加。结论绿色荧光蛋白能够在人结肠腺癌细胞HCT-8中长期稳定表达,用绿色荧光蛋白标记的人结肠腺癌细胞HCT-8建立的裸鼠肿瘤模型为进一步研究结肠肿瘤和相应的药物筛选提供了一种简便、可行的新方法。     

抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤新生血管生成的影响

目的:检测抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤血管生成的影响.方法:建立裸鼠肝癌H22细胞原位移植瘤模型,随机分成生理盐水组(n=12)和抗体组(n=12).采用免疫组织化学SP染色法对两组肝脏移植瘤进行血管染色,观察其微血管密度(MVD)情况.结果:成功建立裸鼠H22肝癌原位移植瘤模型,HE染色显示肝脏移植瘤为肝细胞肝癌,免疫组化结果显示肝脏实体瘤内微血管密度抗体组较生理盐水组显著性减少(25.64± 1.53 vs 8.65± 1.79,P＜0.05).结论:抗VEGFR-2嵌合Fab抗体能够抑制裸鼠肝癌原位移植瘤的血管生成.     

人结直肠癌细胞HCT116红色和绿色荧光标记肿瘤模型的建立

目的筛选表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白基因的人的单克隆结直肠癌细胞系,为体内监测肿瘤的早期生长建立一种新的肿瘤动物模型。方法以脂质体2000介导chickenβ-actin-GFP-neo和chickenβ-actin-DsRed-neo转染人结直肠癌细胞HCT-116,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达红色和绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养。BALB/CA-nu裸鼠皮下接种1×10^6个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达GFP、DsRed的人结肠癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤,利用活体成像系统观察了肿瘤的生长过程,肿瘤的发光随着观察时间的延长而增加。结论红色和绿色荧光蛋白能够在人结直肠癌细胞HCT-116中长期稳定表达,用红色和绿色荧光蛋白标记的人结直肠癌细胞HCT-116建立的裸鼠肿瘤模型为进一步研究结肠肿瘤和相应的药物筛选提供了一种简便、可行的新方法。     

心肌组织特异性Isca1敲除造成新生大鼠心脏结构异常

目的通过对心肌组织特异性Isca1敲除大鼠进行磁共振分析及病理学分析,探究心肌特异性敲除Isca1对大鼠心脏结构影响。方法繁育心肌组织特异性Isca1敲除大鼠,PCR技术鉴定大鼠基因型及基因敲除效率,对新出生0.5d及2.5d心肌组织特异性Isca1敲除大鼠进行核磁共振影像分析,对新出生2.5d心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心肌组织进行H&E染色及透射电镜分析。结果心肌组织特异性Isca1敲除大鼠敲除效率大于78%;与野生型相比,0.5d心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心脏未见显著扩张;2.5d心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心脏右室呈扩张趋势;2.5d心肌组织特异性Isca1敲除大鼠肌纤维排列不齐,出现排列紊乱,无层次或极向,部分心肌纤维出现溶解断裂,肌节和Z线模糊,出现肌膜损伤,线粒体嵴断裂,肿胀明显。结论心肌组织特异性Isca1敲除造成新生大鼠心脏结构异常。     

基于固态基底的SERS免疫检测新方法研究

目的:通过引入新型表面增强拉曼散射(SERS)检测探针(Au-DTNB-Tyr NPs)和金标银染技术,建立基于固态硅片基底的SERS免疫检测新技术。方法:羊抗人IgM-HRP作为检测抗体,在硅片基底上检测不同浓度的人IgM,HRP催化SERS检测探针沉积,利用金标银染技术增强SERS信号。结果:所建立的SERS免疫检测新方法检测人IgM的检测限为10 pg/mL,且SERS信号强度与人IgM浓度具有良好的线性关系(R2=0.993)。结论:基于硅片基底的SERS免疫检测新技术可高灵敏地定量检测人IgM,为实现固态硅片基底对多种抗原的高通量集成化检测奠定了基础。     

抗肿瘤药物Rigosertib研究进展

Rigosertib是一种非ATP竞争性多激酶抑制剂,具有显著的抗有丝分裂和抗癌活性,可诱导多种肿瘤细胞增殖停滞和凋亡,对正常细胞增殖的影响很小。Rigosertib已作为高危骨髓增生异常综合征患者的治疗药物应用于Ⅲ期临床试验。本文就Rigosertib的分子作用机制、体内外抗肿瘤活性以及临床试验等方面的研究进展做简要综述。     

胆囊结石患者血清microRNA表达谱及其意义

目的:建立胆囊结石患者与健康人的血清microRNA(miRNA)表达谱,并分析其差异miRNA功能。方法:收集解放军总医院诊治的胆囊结石患者的血清(试验组)及健康人的血清(对照组),采用miRNA测序技术,建立胆囊结石患者的miRNA表达谱,并通过qPCR技术验证其差异miRNA,利用生物信息学技术预测其差异miRNA的生物功能。定量资料以x±s描述,两组数据间比较采用t检验。结果:试验组与对照组miRNA表达谱序列分别为14 899 245和11 783 121个,miRNA种类分别为686和633个,其差异表达miRNA为16个,均为下调。GO分析显示差异miRNA的靶基因在细胞过程上富集于细胞转化、生物调节和代谢过程等,在细胞组成上富集于细胞成分和细胞器成分等,在分子功能上富集于结合和活性催化等;KEGG功能分析显示差异miRNA的靶基因主要参与环腺苷酸、催产素、生物节律等代谢通路。利用qPCR方法验证miR-1228、miR-1249、miR-3614和miR-766在2组间差异趋势与测序结果基本一致,其中miR-1228、miR-3614和miR-766在2组间存在统计学差异,而miR-1249无统计学差异。结论:血清中的差异miRNA在胆囊结石的形成中可能发挥重要作用,其对胆囊结石疾病的防治具有重要意义。     

新型2-喹诺酮类Polo样激酶1抑制剂的设计合成及分子对接研究

目的:设计合成新型2-喹诺酮类Polo样激酶1(Plk1)抑制剂。方法:以Plk1抑制剂ON 01910为先导化合物,利用生物电子等排原理设计一系列2-喹诺酮类衍生物,用Autodock软件将该类化合物与Plk1进行分子对接和虚拟筛选,计算结合自由能;以取代的氯(溴)苄为起始原料,先后经巯基乙酸取代、双氧水氧化、与(对甲氧基)苯胺酰化,再经环合、水解制得目标化合物。结果:设计的化合物大多数与Plk1的结合自由能均比ON 01910的低,结合强度高、稳定性好;合成了16个2-喹诺酮类衍生物,产物结构经1H-NMR确证。结论:所得化合物中有15个为新化合物,化合物的结构设计科学合理,虚拟筛选结果良好,为后续实体筛选和化合物结构优化提供了理论依据和参考。     

基于转录组测序探索创伤弧菌MO6-24/O小RNA

目的:基于转录组测序注释,探索创伤弧菌MO6-24/O小RNA(sRNA)。方法:在海洋培养基2216E中培养创伤弧菌MO6-24/O,收集从对数生长期到静止期不同时间点的细菌,提取细菌RNA,通过富集sRNA以及去除核糖体RNA进行建库和测序,然后将读段匹配到创伤弧菌MO6-24/O基因组并进行注释,最后进行验证。结果:发现59个顺式编码sRNA、102个反式编码sRNA,并进行了部分验证。结论:鉴定出创伤弧菌MO6-24/OsRNA。     

小鼠胚胎干细胞定向血管内皮和造血细胞分化体系的建立

目的:建立小鼠胚胎干细胞体外定向分化为血管内皮细胞和造血细胞的体系,并验证诱导后2种细胞的表面分子特征。方法:以小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,首先在无血清培养基StemPro中加入骨形态发生蛋白4(BMP4)、激活素A、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-Basic)和血管内皮细胞生长因子(VEGF),诱导小鼠胚胎干细胞系R1/E 4 d后形成拟胚体;再将拟胚体消化后与OP9-DL1基质细胞共孵育,分别用干细胞因子(SCF)、VEGF和SCF、FLt3、白细胞介素3(IL-3)诱导向内皮和造血2个方向分化,并以CD31、CD45、CD144、Kit、CD201作为表面标志,流式检测诱导后细胞的表面分子特征和诱导效率;诱导10 d后免疫组化染色,进行内皮细胞的形态学鉴定。结果:诱导分化10 d后,免疫组化染色观察到多个内皮管状结构,流式检测CD31^+的内皮细胞比例为1.35%±0.05%,进一步分析CD31^+CD144^+CD45^-群体,有3.0%±0.2%的细胞表型为Kit^+CD201^+,提示该部分细胞可能是处于分化上游的内皮干祖细胞;CD45^+的造血细胞比例为35.0%±0.5%,其中0.35%±0.05%的细胞表达Kit和CD201,提示该部分细胞可能是处于分化上游的造血干祖细胞。结论:本研究将胚胎干细胞诱导为内皮细胞和造血细胞,并且能诱导出具有内皮、造血干祖细胞分子特征的细胞,可作为理想的体外诱导分化体系。     

应用流式细胞Index Sorting技术研究小鼠胚胎生血内皮细胞

目的:应用流式Index Sorting技术鉴定小鼠胚胎期d10(E10)的主动脉中生血内皮细胞(HEC)的表面分子表达特征,并结合体外孵育实验及免疫组化染色验证HEC的生血潜能。方法:已有研究显示细胞表面分子Kit和CD47均能标记造血相关群体。在此基础上,应用流式细胞Index Sorting技术分选单个分子表型为CD41^-CD43^-CD45^-CD31^+Kit^+的主动脉内皮细胞,并与基质细胞OP9-DL1共孵育诱导培养7 d,进而结合单个内皮细胞的流式分选特征参数,及诱导后生成CD45^+造血细胞和CD31^+内皮细胞的效率,综合回溯分析Kit和CD47富集HEC的效果。结果:具有生血潜能的HEC均富集在CD47^+内皮细胞群体中,CD47分子将HEC群体的精度提高1.5倍;CD47^+内皮群体中,仍有60%以上的内皮不具备生血能力,提示进一步探索寻找富集HEC表面标志的必要性。结论:应用流式细胞Index Sorting技术发现CD47分子能显著富集小鼠胚胎期HEC,为进一步精准富集并研究HEC提供了重要的技术手段。     

稳定表达猪APOBEC3F的PK15细胞单克隆株的建立

目的:利用慢病毒载体建立稳定表达猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(pAPOBEC3F,简称pA3F)的PK15细胞系。方法:以实验室前期构建的pBPLV-flag-pA3F质粒为模板,PCR扩增pA3F基因,克隆到pLenti-Puro-3Flag载体构建成pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒,Western印迹鉴定其在HEK293T细胞中的表达;将pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒与包装载体共转染HEK293T细胞,包装成Lenti-pA3F慢病毒并测定病毒滴度;将Lenti-pA3F慢病毒感染PK15细胞,通过嘌呤霉素压力筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达pA3F的细胞单克隆株,最终Western印迹检测细胞单克隆株中pA3F的表达。结果:菌落PCR和序列测定表明pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒构建正确,Western印迹显示该质粒可在HEK293T细胞中表达pA3F蛋白;包装了Lenti-pA3F慢病毒,滴度为1.32×10~8TU/mL,慢病毒感染PK15细胞后可检测到pA3F蛋白的表达;经Western印迹鉴定,筛选得到的单克隆细胞可稳定表达pA3F蛋白。结论:建立了稳定表达pA3F的PK15细胞单克隆株,为进一步深入研究猪内源性反转录病毒在pA3F作用下的免疫逃逸机制奠定了基础。