荧光素酶标的人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和PET-CT成像比较

目的利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞株BEL-7402建立裸鼠肝原位移植模型,及小鼠肝原位移植模型的生物发光和小动物PET-CT成像的比较。方法构建表达荧光素酶基因的真核表达载体并将其转入人肝癌细胞BEL-7402,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆并扩大培养。BALB/cA-nu裸鼠肝门静脉接种5×105个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像和小动物PET-CT成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达Luc的人肝癌细胞株,将其接种到裸鼠体内,活体荧光成像系统观察发现能够成瘤,小动物PET-CT影像观察发现小鼠肝脏边缘对18 F-FDG有高摄取区域。结论利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型,小动物活体成像结合小动物PET-CT技术为原位肿瘤模型的建立提供了一种新的可靠的技术,为进一步研究肝癌生长转移机制和药物开发提供了新的有用工具。     

小鼠CYP2E1基因靶向miRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计并构建靶向小鼠CYP2E1基因的miRNA干扰质粒,为探索CYP2E1基因功能奠定基础。方法应用invitrogen设计软件设计两条干扰小鼠CYP2E1基因的靶向miRNA序列,合成相应的回文DNA序列,退火后分别连接到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体上,构建两套miRNA真核表达载体CYP2E1-miR1和CYP2E1-miR2,并使用该载体特有的串联方法将两载体上的miRNA前体寡核苷酸序列进行串联成为CYP2E1-miR1-miR2;将上述重组载体分别与构建的pcDNA3.1（＋）-CYP2E1表达质粒共转染入293T细胞,RT-PCR法鉴定其干扰效果。结果经酶切及测序鉴定,针对鼠CYP2E1基因的miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制共转染入293T细胞的pcDNA3.1（＋）-CYP2E1质粒的表达,且串联质粒CYP2E1-miR1-miR2优于单独的干扰质粒CYP2E1-miR1及CYP2E1-miR2。结论小鼠CYP2E1基因的靶向miRNA表达载体构建成功。     

不同接种量荧光素酶标记小鼠乳腺癌细胞4T1在小鼠体内生长及肺转移的比较

目的 采用活体成像技术比较四种剂量荧光素酶标记肿瘤细胞在小鼠体内生长及肺转移情况,为光学标记肿瘤模型的药物筛选或机制研究提供参考资料.方法 以荧光素酶作为报告基因导人小鼠乳腺癌细胞4T1中,经G418筛选获得稳定表达荧光素酶的细胞克隆并扩大培养.标记细胞稀释成1×107细胞/mL,2×107细胞/mL,5×107细胞/mL和1×108细胞/mL四种剂量,取0.1 mL接种子BALB/c小鼠右侧第二对乳腺脂肪垫内,制作小鼠原位乳腺癌模型,比较肿瘤细胞在小鼠体内生长及肺转移情况.结果获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆,在致瘤性方面和亲代细胞无明显差别,四种剂量细胞接种BALB/c小鼠后,均有肿瘤生长,接种第28天时,四种剂量接种的原位移植瘤大小没有明显差别,但接种两个高剂量肿瘤细胞的小鼠组各有2只小鼠死亡;接种后31 d,发现四种剂量接种的原位移植瘤均发生不同程度的转移,随着观察天数的增加,转移程度逐渐严重,接种后42 d,小鼠陆续发生死亡.结论 根据转移和死亡情况,确定接种1×106个细胞/只不仅肺转移明显,而且存活时间一般超过45 d,比高剂量接种存活时间长,为最佳肺转移剂量.     

绿色荧光裸鼠的建立和验证

目的建立系统性表达绿色荧光蛋白的裸鼠,接种人源肺癌细胞验证该模型是否具有免疫缺陷性,并观察双色荧光的成像效果。方法利用系统性表达绿色荧光蛋白的C57BL/6J小鼠与BALB/C裸小鼠多代杂交和互交,建立稳定表达绿色荧光蛋白的裸鼠。大体解剖观察胸腺生长情况,整体和器官荧光成像验证绿色荧光蛋白的表达情况。以2×106/只的剂量对其皮下腋下接种表达红色荧光蛋白的人类A549肺癌细胞（RFP-A549）,通过观测肿瘤生长来验证模型的免疫缺陷性。同时,利用红色荧光标记的肿瘤和绿色宿主鼠,对双色的整体成像效果进行观测。结果构建出系统性表达绿色荧光蛋白的裸鼠,大体解剖可见胸腺缺失。在激发光的激发下,绿色荧光裸鼠全身发出清晰的绿色荧光,脑、心脏、肺脏、肝脏、肾脏,肠胃及胰腺等主要器官可见明显绿色荧光。接种RFP-A549细胞后,成瘤率达到100%,整体动物荧光成像表现出清晰的双色。结论本研究构建出的绿色荧光裸鼠,动物整体可以清晰地表达绿色荧光并具有免疫缺陷性     

SW1990和Capan-2红色荧光标记胰腺癌移植肿瘤模型的建立和比较

目的建立稳定表达红色荧光蛋白基因的人胰腺癌细胞系,为体内监测肿瘤的早期生长及抗肿瘤药物的药效评价建立一种新的肿瘤动物模型。方法以Lipofectamine 2000介导chickenβ-actin-RFP-NEO转染人胰腺癌细胞SW1990和Capan-2,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养。BALB/cA-nu裸鼠皮下接种1×106个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达RFP的两种不同的人胰腺癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤,利用活体成像系统观察了肿瘤的生长动态过程,并且SW1990肿瘤细胞的生长速度较Capan-2细胞快。结论用红色荧光蛋白标记的人胰腺癌细胞建立的裸鼠肿瘤模型为胰腺癌的研究和相关药物筛选提供了可进行荧光影像活体、动态分析的动物模型。     

人胰腺癌裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和超声成像比较

目的利用荧光素酶基因标记的人胰腺癌细胞株Capan-2建立胰腺癌裸鼠移植模型,评价生物发光和小动物超声成像在移植瘤模型建立中的作用。方法将表达荧光素酶基因的真核表达载体转入人胰腺癌细胞Capan-2,将1×106人胰腺癌细胞悬液分别接种于裸鼠胰腺和右后肢皮下,使其成瘤。生物发光成像和小动物超声成像系统观察肿瘤的生长情况。结果肿瘤细胞原位移植成功率为75%,皮下移植成功率为100%。生物发光成像系统在肿瘤细胞原位接种第7天,可以观察到肿瘤发光;小动物超声成像系统在肿瘤细胞皮下接种第7天,可以测量肿瘤的大小,但在肿瘤细胞原位接种的第7天不能测量肿瘤的大小。另外肿瘤细胞在裸鼠皮下生长的速度比原位生长速度快3倍左右。结论生物发光成像系统更适用于肿瘤早期监测,为深入研究胰腺癌的发生发展、侵袭转移机制提供理想工具。     

荧光素酶标记人胃癌细胞裸鼠原位移植模型的建立

目的建立荧光素酶标记人胃癌原位异种移植模型。方法将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入人胃癌MGC803细胞,建立稳定表达荧光素酶的细胞,将其接种裸鼠胃壁浆膜下,建立胃癌裸鼠原位肿瘤模型。用活体荧光成像系统检测肿瘤的发生发展,并进行小动物超声影像和病理学分析。结果裸鼠原位成瘤率为100%,活体荧光成像观察发现在接种第7天,就可以观察到肿瘤发光。21 d后肿瘤进入对数生长期,28 d后肿瘤出现明显坏死,平均荧光光子数呈现下降趋势。超声成像发现小鼠胃部有直径为8.39 mm,面积为28.92 mm2瘤块。结论荧光素酶标记可以实时监测原位异种移植人胃癌生长状况。     

抑制小鼠乳腺肿瘤转移 microRNA 的筛选

目的：鉴定25种microRNA的功能及其在乳腺癌中发挥的作用,以筛选新的抑制乳腺癌转移的microRNA分子。方法利用脂质体2000将25种鼠源microRNA表达载体转染至4TO7细胞,经G418筛选结合流式细胞仪分选获绿色荧光细胞得稳定表达鼠源microRNA 的细胞株。将细胞2＆#215;105个/只尾静脉注射接种于BALB/C小鼠,14 d后解剖分离肺组织,统计小鼠肺组织结节数目。结果和接种阴性对照细胞小鼠相比,接种mir-449a稳转细胞的小鼠肿瘤肺转移减少。而接种 mir-1935稳转细胞的小鼠肿瘤肺转移增多。其它23种microRNA稳转细胞接种小鼠肿瘤肺转移既不增加也不减少。结论从25种鼠源microRNA中筛选到2种与乳腺癌肿瘤转移相关的microRNA：mir-449a抑制乳腺癌细胞肺转移,mir-1935则促进癌细胞肺转移。     

声化学激活原卟啉Ⅸ杀伤艾氏腹水瘤细胞的分子机理

采用频率为2.2 MHz、声强为3 W/cm2 的低强度聚焦超声结合原卟啉Ⅸ对艾氏腹水瘤细胞的损伤进行研究, 并初步探讨其作用的生物学机制.分别用荧光分光光度法、激光共聚焦扫描显微镜分析原卟啉Ⅸ在肿瘤细胞内的积聚、定位情况;利用台盼蓝拒染法测定聚焦超声激活原卟啉Ⅸ对细胞存活率的影响;透射电镜观察细胞的超微结构变化;罗丹明123检测线粒体膜电位变化;2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(2',7'- dichlorodihydrofluorescin diacetate, DCFH-DA)检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平;硫代巴比妥酸法检测细胞膜脂质过氧化水平的变化.通过研究发现,艾氏腹水瘤细胞对原卟啉Ⅸ有一定的选择性吸收和潴留作用,原卟啉Ⅸ主要定位于细胞的线粒体中;在超声结合原卟啉Ⅸ作用下,艾氏腹水瘤细胞的存活率明显下降;细胞的超微结构发生明显损伤;线粒体膜电位下降;ROS生成量显著增加;脂质过氧化水平显著增加.研究结果表明:超声激活原卟啉Ⅸ对艾氏腹水瘤细胞有着明显的协同杀伤效应,其间产生的活性氧自由基作用,降低线粒体膜电位,增加膜的脂质过氧化水平,可能是其损伤艾氏腹水瘤细胞的主要因素之一.     

实验动物准备对裸鼠移植瘤模型microPET 显像的影响

目的 探讨实验动物准备条件对18 F-FDG microPET 裸鼠移植瘤模型显像的影响,以选择最佳的实验动物准备条件.方法 36 只人表皮样癌细胞A431 裸鼠皮下移植瘤模型.随机分为6 组（6 只/组）;A 组：无禁食、室温（20 ～22）℃、无麻醉（注射18 F-FDG 后60 min 清醒状态）、尾静脉注射18 F-FDG;B 组：禁食（6 ～8）h、加温（30 ～32）℃、麻醉（吸入2%异氟烷麻醉）、尾静脉注射18 F-FDG;C 组：无禁食、加温、麻醉、尾静脉注射18 F-FDG;D组：禁食、室温、麻醉、尾静脉注射18 F-FDG;E 组：禁食、加温、无麻醉、尾静脉注射18 F-FDG;F 组：禁食、加温、麻醉、腹腔注射18 F-FDG.注射18 F-FDG 约1 h 后,行microPET 显像,测量皮下移植瘤、颈部肌肉、棕色脂肪、脑、肝脏、肾脏、心脏、哈氏腺最大每克组织摄取率（%ID/gmax ）.扫描前裸鼠均测血糖.结果 （1）B 组、C 组、F 组裸鼠的血糖水平与肿瘤摄取之间均呈直线负相关.（2）棕色脂肪：A 组摄取最高（8.03 ±1.29）,B 组摄取降低71.98%（P ＝0.000）.颈部肌肉：A 组摄取最高（16.07 ±5.20）,B 组摄取降低最多达81.84%（P ＝0.000）.各组脑、心脏、肝脏、肾脏、哈氏腺摄取差异无统计学意义.（3）A 组皮下移植瘤/组织或器官的摄取率最低.B 组移植瘤/颈部肌肉,移植瘤/肝脏,移植瘤/棕色脂肪的摄取率较A 组分别升高6.50 倍、1.29 倍、4.76 倍（P 均＜0.05）,肿瘤与组织或器官的图像对比度明显改善.（4）第1 次microPET 显像,尾静脉注射与腹腔注射皮下移植瘤摄取值差别无统计学意义（P ＝0.364）.第2 次microPET 显像,腹腔注射腹腔可见不同程度显像剂浓聚,其他正常组织、器官及皮下移植瘤的摄取均减低.腹腔注射方式,两次皮下移植瘤的摄取值差异有统计学意义（P ＝0.025）.结论实验动物准备明显影响18 F-FDG 在裸鼠正常组织的分布及皮下移植瘤的摄取.禁食、加温、麻醉及尾静脉注射方式,可以改善肿瘤对18 F-FDG 的摄取,保证图像有较好的稳定性及可重复性.