牛γ 干扰素的表达及其抗病毒活性测定

通过RT-PCR从经ConA刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛γ干扰素 (BoIFN-γ) cDNA,克隆到真核载体pVAX1中,测序结果显示pVAX1中的插入序列BoIFN-γ基因与已报道序列一致。用重组质粒pVAX1-BoIFN-γ转染COS-7细胞并进行间接免疫荧光试验鉴定,结果显示BoIFN-γ在COS-7细胞中得到成功表达。将BoIFN-γ基因克隆到原核表达质粒pET-30a(+)、pGEX-6p-1后,分别转化重组表达菌BL21(DE3)、BL21后,通过对表达条件的优化,SDS-P     

表达人γ-干扰素的重组腺病毒的制备及检测

El区缺失的腺病毒载体插入人γ-干扰素cDNA序列．与pJM17质粒通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞．经同源重组．共获得6个病毒噬斑。经PCR共扩增检测．证实这6个噬斑均为带有人γ-干扰素cDNA的重组腺病毒;受其感染的293细胞的上清中,都能洲到γ-干扰素的活性,且这种活性可被一定稀释度的兔抗人γ-干扰素多克隆抗体所中和。其中的1号重组病毒纯化后,接不同的M()I(Multiple of infection)值感染复制缺陷型腺病毒不能在其中增殖的B16F10细胞,未出现细胞病变效应(cytopalhic effect,CPE)．而上清中的γ-干扰素活性却随M()I值增大而升高,这证实构建的复制缺陷型腺病毒是能表达井分泌人γ-干扰素的。     

树鼩γ干扰素在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性鉴定

目的:克隆树鼩γ干扰素(IFNγ)基因,在大肠杆菌中高效表达纯化并鉴定其免疫原性。方法:提取树鼩肺组织总RNA,经RT-PCR扩增出树鼩IFNγ基因,再克隆到原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩IFNγ;经金属螯合柱复性及纯化,Western印迹和ELISA检测其免疫原性,并检测不同组织中IFNγ的分布情况。结果:构建了重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,重组蛋白在30℃、1 mmol/L IPTG诱导4 h获得较高表达量,镍柱复性纯化后得到较高纯度的树鼩IFNγ。Western印迹显示IFNγ可与兔抗人IFNγ单克隆抗体特异性结合,应用Western印迹和ELISA分别检测树鼩IFNγ的免疫原性和抗体滴度,在树鼩的鼻、心、肝、肺、肾、气管中检测到IFNγ。结论:在大肠杆菌中高效表达了重组树鼩IFNγ,复性纯化后具有良好的免疫原性。     

人αD型干扰素cDNA 3′端非编码序列对该基因在大肠杆菌中表达的影响

本文采用DNA体外重组技术,研究了人αD型干扰素cDNA 3′端非编码序列对该基因在大肠杆菌中表达的影响。发现3′端非编码序列的缺失,使得人αD型干扰素基因在大肠杆菌中的表达水平降低约87倍。这一结果提示,在进行人αD型干扰素cDNA在大肠杆菌中的表达设计时,有必要保留其3′端非编码序列。     

鸡γ-干扰素在杆状病毒系统中的表达

目的：获得具有生物学活性的重组鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）。方法：应用RT-PCR方法扩增ChIFN-γ基因cDNA,将其克隆入杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1,构建重组质粒pFast-ChIFN-γ,通过位点特异性转座,将ChIFN-γ基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组质粒pBac-ChIFN-γ并转染昆虫细胞Sf9,采用间接免疫荧光试验（IFA）、ELISA试验鉴定重组ChIFN-γ的表达,通过细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性。结果：IFA、ELISA与细胞病变抑制试验结果显示,重组ChIFN-γ在杆状病毒系统中获得表达,其抗病毒活性达5×103～1×104U/mL。结论：重组ChIFN-γ的获得为其开发应用提供了重要的生物材料。     

中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用RT-PCR技术从中国人淋巴细胞mRNA反转录产物中克隆了IFN-γcDNA,序列分析证实了分子进化规律对IFN-γcDNA序列存在多态性的推论.在此基础上应用DNA重组技术,将去信号肽中国人IFN-γcDNA克隆到原核表达质粒pBV220 P_RP_L启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人IFN-γcDNA,其表达水平占全菌可溶性总蛋白的44.4%,初步复性后生物学活性测定结果表明γ-IFN表达量为0.45×10⁷～2.34×10⁷单位/L.     

鸡α干扰素基因的克隆与表达

通过对鸡α干扰素基因的克隆,获取一定纯度的干扰素蛋白.从NCBI上搜索出鸡α干扰素基因的序列,根据其成熟蛋白编码序列设计引物,通过PCR从家鸡肝脏基因组中扩增出成熟鸡α干扰素的编码基因,利用基因重组技术构建出pUcm-T/IFN-α,再亚克隆至载体质粒pET-43.1a( ),构建出pET-43.1a( )/IFN-α重组质粒,经酶切鉴定、DNA测序,证明重组质粒构建正确.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行发酵,IPTG诱导表达后进行纯化及SDS-PAGE分析.工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子量约19kDa的位置出现明显目的条带,约占菌体总蛋白的30%,表达产物主要以包涵体形式存在,经过NI2 -NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳后经凝胶扫描纯度达95%以上.获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对鸡α干扰素进行复性及活性研究奠定了基础.     

人Tumstatin在毕赤酵母中的表达和活性分析

利用PCR技术从重组质粒pET-3c-tum中扩增人tumstatin的cDNA片段,连入pPICZαA酵母表达载体,获得的重组质粒pPICZα-tum电激法转化毕赤酵母GS115。经表型鉴定、诱导表达筛选,得到可分泌表达人tumstatin的重组酵母转化子,表达蛋白质的相对分子量约30kD,表达量约25mg/L。表达上清经超滤浓缩和离子交换法初步纯化,所得产物具有免疫活性,能够抑制内皮细胞增殖,诱导其发生细胞凋亡,并能抑制鸡胚尿囊膜血管生成。     

重组人r干扰素的纯化及其N端氨基酸序列分析

本文对两个重组人γ干扰素高效表达株pIFN-γ及PBVIFN-γ的表达产物进行了纯化并对纯化的γ干扰素进行了活性鉴定及N端氨基酸序列分析。采用连续沉淀的方法对高表达菌株pBVIFN-γ及低表达菌株pIFN-γ,裂解液进行初步纯化,然后应用单克隆抗体亲和层析方法进行纯化,分别可纯化14倍与933倍,均达电泳纯,回收率分别为25％和30％,比活性达7.56×10~7U/mg蛋白。SDS-PAGE电泳上γ干扰素分子量约17.5kD。测定了纯化的γ干扰素N末端19个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致,确认了本研究所表达、纯化的γ干扰素达到了较高纯度。本方法为γ干扰素的批量生产奠定了基础。     

北极狐γ-干扰素cDNA的克隆、表达及活性测定

为研究狐γ-干扰素的生物学活性,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从北极狐外周血淋巴细胞中扩增出γ-干扰素(VuIFN-γ)cDNA.序列分析表明VuIFN-γcDNA全长501 bp,编码23个氨基酸的信号肽和144个氨基酸的成熟肽蛋白,与已发表的银黑狐和犬IFN-γ核苷酸序列同源性为99.8%和99.4%;氨基酸同源性均为100%.应用原核表达系统高效表达北极狐γ-干扰素成熟肽蛋白,SDS-PAGE和Western blotting分析表达的融合蛋白分子量约为19 kD,以不溶性的包涵体形式存在.重组蛋白经纯化和复性,在Vero和MDCK细胞上可明显抑制VSV病毒的复制,并测出北极狐重组γ-干扰素的活性单位分别为1.0×106 u/mg和1.56×105 u/mg,为进一步开发基因工程狐干扰素奠定基础.