重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

带Tat标记质粒载体的构建及其转导融合蛋白进入细胞的研究

采用点突变技术构建了带 6×His、Tat和Flag多个标记的pET HTF的质粒载体 ,利用基因重组技术构建pET HTF EGFP融合蛋白载体 .酶切和DNA测序证明 ,所构建的pET HTF和pET HTF EGFP载体正确 .BL2 1(DE3)表达融合蛋白 ,用Ni2 + 分离柱纯化His Tat Flag EGFP蛋白 ,并加入培养的NIH3T3细胞 .荧光显微镜观察显示 ,His Tat Flag EGFP融合蛋白进入细胞 .带His、Tat和Flag标记的质粒载体pET 14b HTF表达的融合蛋白能够进入细胞 ,该载体为进行蛋白质功能研究和基因治疗研究提供了一个重要工具     

人早胚发育相关蛋白ZNF268的抗体制备

目的:获得纯化抗原用于制备ZNF268的多克隆抗体。方法:PCR扩增目的基因片Spacer区序列,亚克隆入融合蛋白表达载体pET28a+,构建了重组质粒pET28a+/SPA。然后将该重组质粒转化E.coliDE3(Rosseta),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分离,获纯化融合蛋白6His-SPA。用6His-SPA免疫家兔,颈动脉取血,分离血清,从血清中获得ZNF268特异的多克隆抗体。结论:通过构建融合蛋白重组表达质粒pET28a+/SPA,用获得的初步纯化融合蛋白6His-SPA,制备了特异的ZNF268的多克隆抗体6His-SPA Ab。     

融合表达氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE合成L-别异亮氨酸

【背景】L-异亮氨酸(L-isoleucine,L-Ile)和L-别异亮氨酸(L-allo-isoleucine,L-allo-Ile)是自然界中广泛存在的一对同分异构体。抗感染抗生素Desotamides结构中含L-别异亮氨酸结构单元,其生物合成途径中的氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE可以协作催化L-异亮氨酸和L-别异亮氨酸相互转化。【目的】通过理性设计,使氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE融合表达,研究融合蛋白DsaDE催化异亮氨酸和别异亮氨酸相互转化的功能。【方法】利用PCR分别扩增dsaE基因编码区DNA片段、以及含dsaD基因编码区和114个碱基接头序列的DNA片段dsaD-linker,利用酶切位点KpnI将dsaE和dsaD-linker相连,形成das DE重组序列,并克隆至pET28a(+)中,将重组质粒pET28a-dsaDE转化至Escherichia coli BL21(DE3)中进行融合表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白DsaDE;分别以L-异亮氨酸和L-别异亮氨酸为底物进行融合蛋白的体外酶活性检测,利用高效液相色谱对酶反应产物进行分析。【结果】PCR验证、酶切验证以及测序结果证明pET28a-dsaDE重组载体具有正确序列;N-末端和C-末端融合6个组氨酸标签的融合蛋白DsaDE在E. coli BL21(DE3)中获得可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析法一步纯化获得纯度约95%的融合蛋白,纯化的融合蛋白DsaDE具有较好的活性,能够催化L-isoleucine和L-allo-isoleucine间的相互转化。【结论】氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE成功融合表达,经一步Ni-NTA亲和层析法纯化即可获得纯度较高的融合蛋白,融合蛋白同时具有氨基转移酶和异构酶的活性,为进一步研究L-别异亮氨酸的工业化生产奠定了基础。     

人巨细胞病毒编码蛋白pUL23在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化

大肠杆菌中高效表达携带组氨酸标签的人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23,并进行纯化以及鉴定.提取感染HCMV Towne病毒株的HFF细胞的总RNA,逆转录为cDNA作为模板,经PCR获得UL23的基因片段,将此片段插入表达载体pET-28a(+),构建pET28a(+)-UL23重组质粒.将pET28a(+)-UL23转化至大肠杆菌BL21( DE3),进行IPTG诱导表达.表达产物经Western blotting分析后进行发酵,再用Ni sepharose亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测.结果表明,成功构建pET28a(+)-UL23原核表达载体,表达及纯化了His-pUL23融合蛋白.为进一步研究pUL23奠定基础.     

SPA-Luc嵌合基因的构建及其融合蛋白活性检测

目的:葡萄球菌A蛋白-荧光素酶(SPA-Luc)原核表达载体的构建,表达,纯化,并对其生物学效应进行初步研究。方法:PCR扩增SPA和Luc基因,并连接到pET28a(+)中,构建原核表达质粒。构建正确的重组质粒转化至E.coliBL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western Blot鉴定,同时用Ni-NTA亲和层析法纯化SPA-Luc蛋白,最后用荧光素酶试剂盒和ELISA检测融合蛋白的生物学活性。结果:成功构建重组质粒pET28a(+)-SPA、pET28a(+)-Luc和pET28a(+)-SPA-Luc,SDS-PAGE及Western Blot证明正确表达了重组蛋白,并获得了纯化的融合蛋白SPA-Luc。荧光素酶试剂盒检测发现该蛋白仍能与IgG结合,并且与兔和鼠的IgG有较高亲和性。ELISA显示SPA-Luc蛋白替代常规二抗检测抗原,具有更高的敏感性。结论:成功的克隆、表达、纯化的SPA-Luc蛋白可用于抗原抗体的检测,且比常规二抗具有更高的敏感性,为进一步研究其在免疫学中的应用奠定了实验基础。     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及活性鉴定

目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,诱导hFLext蛋白表达、纯化及活性鉴定.方法:以人淋巴细胞cDNA文库为模板,克隆hFlext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体.转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定.细胞增殖实验检测其生物学活性.结果:成功克隆获得hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体.在大肠杆菌BL21,经1 mM IPTG 30℃诱导12 h,成功表达Trx-hFLext融合蛋白,主要以包涵体形式存在.经8M尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白.细胞增殖实验证实其具有生物学活性,能够有效刺激脐血细胞增殖.结论:成功构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体,表达、纯化了具有生物学活性的Trx-hFLext融合蛋白,为造血干/祖细胞的体外扩增研究奠定了基础.     

人蛋白酶体亚基PSMB1的重组表达、纯化及在蛋白酶体抑制剂体外筛选中的应用

蛋白酶体是真核细胞中的一类多亚基蛋白酶复合物,它在胞内蛋白质降解的泛素-蛋白酶体通路中起关键作用。重组表达蛋白酶体的活性亚基可以用于在体外筛选、寻找具有蛋白酶体抑制剂作用的化合物。将人蛋白酶体催化亚基(PSMB1)cDNA的编码区(全长726 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组质粒pET28a-PSMB1,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过1 mmol/L IPTG,20℃过夜诱导,获得相对分子量约为27 kDa的重组蛋白,采用IMAC亲和层析柱纯化重组蛋白,纯化后的重组蛋白纯度超过95%。重组蛋白酶解后经NanoLC-MS/MS鉴定表明所表达的融合蛋白氨基酸序列完全正确。在体外BIAcore分析中,重组蛋白表现出对不同化合物的选择性结合能力,其中与蛋白酶体抑制剂雷公藤红素的结合较强,10μmol/L的雷公藤红素与重组蛋白的结合达到27 RU,并且具有良好的浓度依赖型。本研究建立了表达、纯化人蛋白酶体催化亚基PSMB1的方法,并应用于具有蛋白酶体抑制活性化合物的体外筛选。     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PL A2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了western blot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础.     

山羊Klf4基因克隆、原核表达和His-Klf4融合蛋白纯化北大核心CSCD

旨在克隆山羊Klf4基因,构建重组质粒pET30a-Klf4,通过原核表达技术获得纯化的His-Klf4融合蛋白。从山羊的生殖脊中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Klf4基因编码区序列,通过TA克隆构建pMD18-T-Klf4重组质粒。酶切鉴定与测序分析后将Klf4的cDNA亚克隆至pET-30a载体,构建重组质粒pET30a-Klf4。酶切鉴定后将其导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测确认,镍离子金属螯合亲和层析法纯化His-Klf4融合蛋白。结果表明:(1)从山羊生殖脊中克隆了Klf4基因,其开放阅读框由1 434个核苷酸组成,编码478个氨基酸,而且该序列与绵羊的同源性最高,达到98.5%;(2)经过SignalP 4.0在线分析,Klf4的编码蛋白不存在信号肽;(3)经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,重组质粒pET30a-Klf4在大肠杆菌中得以表达;在变性条件下纯化,获得了His-Klf4融合蛋白。     

Phylogenetic analysis and heterologous expression of surface layer protein SlpC of Bacillus sphaericus C3-41

The surface layer protein encoding genes from five mosquito-pathogenic Bacillus sphaericus isolates were amplified and sequenced. Negative staining of the S-layer protein extracted from the cell wall of wild-type B. sphaericus C3-41 was prepared. It showed a flat-sheet crystal lattice structure. Two genes encoding the entire and N-terminally truncated S-layer protein (slpC and DeltaslpC respectively), were ligated into plasmid pET28a and expressed in Escherichia coli. SDS-PAGE revealed that about 130 KD and 110 KD proteins could be expressed in the cytoplasm of recombinant E. coli BL21(pET28a/slpC) and E. coli BL21(pET28a/DeltaslpC) respectively. Furthermore, an intracellular sheet-like or fingerprint-shape structure was investigated in two recombinant strains, which expressed SlpC and DeltaSlpC protein respectively, by ultrathin microscopy study, but bioassay results suggested that the S-layer protein of wild B. sphaericus C3-41 and recombinant E. coli BL21 (pET28a/slpC) have no direct toxicity against mosquito larvae. These results should provide information for further understanding of the function of S-layer protein of pathogenic B. sphaericus.     

重组人TACE的解整合素域对人肺腺癌A549体外增殖、粘附和侵袭的抑制作用

为了解人TACE的解整合素域对肿瘤细胞粘附和侵袭的影响以及其独立于其他结构域发挥作用的能力,从单核细胞系THP1中提取RNA,RT-PCR扩增出TACE全长基因,构建了pMD18T-TACE载体。对pMD18T-TACE质粒进行PCR,分别扩增T300(300bp,编码解整合素域)、T800(800bp,编码酶催化域)及T1300(1300bp,编码胞外域)三个片段,将其分别亚克隆至表达载体pET28a( )。把质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物均以不溶性包涵体形式存在。经过溶解包涵体、BBSTNTA树脂柱亲和层析并透析复性,获得高纯度的三种活性蛋白。MTT法、细胞粘附实验、Transwell小室侵袭实验分别显示TACE解整合素域、胞外域蛋白均能明显抑制A549细胞的增殖,且以剂量依赖性的方式抑制A549细胞与纤维粘连蛋白的粘附,并能抑制Transwell小室中A549细胞对Matrigel模拟的天然基底膜的侵袭,而酶催化域蛋白则无相应的抑制能力。表明重组TACE解整合素域蛋白可独立抑制肿瘤细胞的增殖、粘附和侵袭,为深入研究该区域的作用及TACE在肿瘤发病中的机制提供了新的认识。     

Efficient expression of membrane-bound water channel protein (Aquaporin Z) in Escherichia coli

In order to explore the possibility of preparing a high-efficiency aquaporin-based biofilter, an efficient approach for expression of membrane-bound Aquaporin Z (AqpZ) in E. coli was proposed. The AqpZ gene was amplified by means of PCR, and two expression vectors (pET28-AqpZ and pET32-AqpZ) were constructed. The channel protein of interest was synthesized in E. coli BL21(DE3)/pET32-AqpZ as an insoluble fusion protein linked with trxA. However, with BL21(DE3)/pET28-AqpZ, significant amount of AqpZ fused only with 6-His (6-His-AqpZ) could be expressed, correctly folded and targeted into the membrane. Under the optimized culture conditions, the highest expression level (9.05 mg/l) of membrane-bound 6-His-AqpZ was achieved with BL21(DE3)/pET28-AqpZ, and an additional amount (2.35 mg/l) was expressed concomitantly as the inclusion body form. This expression result was 3.5 times higher than that in the previous studies.     

信号肽对短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中表达的影响

从Brevibacterium sp．DGCDC-82染色体DNA中扩增出含信号肽序列的胆固醇氧化酶结构基因,插入大肠杆菌表达载体pET28a（＋）中,构建重组质粒pET28a—COD（s＋）。以pET28a-COD（s＋）为底物,扩增出不含信号肽的胆固醇氧化酶结构基因,构建成重组质粒pET28a-COD（s-）。两种重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）通过IPTG诱导均获得活性表达,SDS-PAGE分析,目的产物表达量都占到了细胞总蛋白的50％以上,Brevibacterium sp．DCR2DC-82胆固醇氧化酶的信号肽对重组酶的空间构象和表达量并没有太大的影响。     

牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB51成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。通过TA克隆技术,将PCR产物克隆至pGEMT Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEMT51。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEMT51和pET28a(+),并将纯化的MPB51基因亚克隆至pET28a (+)中,构建出原核表达质粒pET28a51。将pET28a51转化至感受态E.coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导和SDSPAGE分析,可见约30kD外源蛋白带。Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB51的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础。     

Cloning and expression of Mycobacterium bovis secreted protein MPB83 in Escherichia coli

The gene encoding MPB83 from Mycobacterium bovis Vallee111 chromosomal DNA was amplified by using polymerase chain reaction (PCR) technique, and the PCR product was approximately 600bp DNA segment. Using TA cloning technique, the PCR product was cloned into pGEM-T vector and the cloning plasmid pGEM-T-83 was constructed successfully. pGEM-T-83 and pET28a(+) were digested by BamHI and EcoRI double enzymes. The purified MPB83 gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-83 was constructed. Plasmid containing pET28a-83 was transformed into competence Escherichia coli BL21 (DE3). The bacterium was induced by isopropyl-Beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and its lysates were loaded directly onto sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), approximately 26 kDa exogenous protein was observed on the SDS-PAGE. The protein was analyzed using Western-blotting. The results indicated that the protein was of antigenic activity of M.bovis. The results were expected to lay foundation for further studies on the subunit vaccine and DNA vaccine of MPB83 gene in their prevention against bovine tuberculosis.     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化简

目的：构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到厅sE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果：构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0．1mmol/LIPTG诱导3h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论：实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达、纯化与结构分析

将猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)BJ 4毒株N基因克隆至原核表达载体pET2 8a中 ,得到重组表达载体pET2 8 N ,转化EscherichiacoliBL2 1(DE3)细胞 ,获得可溶性表达 ,表达量占菌体蛋白的 2 8%。经ProbandNi2 亲和层析获得重组蛋白P2 8 N ,圆二色谱 (CD)测定结果表明 ,P2 8 N重组蛋白螺旋占 2 6 1% ,折叠占 2 3 7% ,转角 19 8% ,卷曲占 30 3%。并进一步绘制出PRRSVN蛋白的二级结构图     

传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR技术,从传染性法氏囊病病毒（IBDV）Gx,Gt毒株中分别扩增出VP5基因,将其克隆到表达载体pET30a、pET28a中。经PCR、酶切和序列分析鉴定获得重组质粒命名为pET28a-GtVP5、pET30a-GxVP5。将pET30a-GxVP5、pET28a-GtVP5分别转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下均成功表达约24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-VP5融合蛋白,并都以包涵体形式存在。将Gx-VP5纯化后的蛋白免疫8周龄BALB/c雌鼠,ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:25600以上,Western blot分析VP5表达产物能与抗6×His mAb及抗IBDV多克隆抗血清发生反应,具有良好的免疫反应特异性。     

大肠埃希菌—双歧杆菌穿梭表达载体的构建及白介素-10基因的表达

目的构建能够在大肠埃希菌和双歧杆菌中穿梭表达目的基因的载体,并用此载体在大肠埃希菌和双歧杆菌中表达人白介素-10基因（hIL-10）的蛋白产物;为hIL-10基因重组双歧杆菌治疗炎症性肠病做前期准备。方法以质粒pDG7为模板扩增pMB1片段,构建表达质粒pET28B1。用PCR法扩增hIL-10基因,将此目的基因以及pET28B1经酶切后用连接酶连接,形成重组质粒pET28B1-hIL10。pET28B1-IL10转染大肠埃希菌BL21和长双歧杆菌。最后用Western blot检测hIL-10基因在大肠埃希菌和长双歧杆菌中的表达情况。结果pET28B1-hIL10阳性克隆扩增后提取质粒并进行基因测序,结果显示插入片段为hIL-10,序列正确且无突变。hIL-10基因在大肠埃希菌、长双歧杆菌中的诱导表达产物通过Western blot检测验证为IL-10蛋白,显示该hIL-10表达载体在大肠埃希菌阳性克隆中经诱导可高量表达,在长双歧杆菌体中有少量表达。结论成功构建质粒pET28B1,该质粒能够在大肠埃希菌和双歧杆菌中穿梭表达目的基因hIL-10。