茶树开花相关基因家族的克隆及CsMFT基因的可变剪切分析

开花是植物从营养生长到生殖生长转变的关键过程,PEBP(phosphatidylethanolamine binding protein)蛋白家族在植物开花过程中发挥重要调控作用。该研究分别采用信息学分析及RT PCR方法,对茶树CsPEBP基因家族进行了鉴定、克隆和表达分析。结果表明：(1)成功克隆获得5个PEBP基因家族成员,并分别命名为CsATC、CsMFT、CsBFT、CsFT和CsTFL1,其长度为519~525 bp,分别编码172~174 个氨基酸残基,定位于5条不同染色体。(2)结构分析显示,该蛋白家族不同成员氨基酸序列的相似性高达72.7%,含39.88%~42.28%的自由卷曲,分属于3个亚家族,其亲缘关系与杨树最近。(3)亚细胞定位分析显示,CsATC、CsMFT、CsBFT定位于细胞质, CsFT定位于细胞核,CsTFL1定位于细胞质和细胞核。(4)转录组和荧光定量PCR分析显示,CsMFT基因在茶树不同组织部位和不同非生物胁迫响应下的表达量均高于其他基因;CsFT、CsATC、CsMFT基因在茶树花半开时的表达量最高。(5)启动子元件分析显示,该基因家族的启动子中含有大量的光响应元件和激素响应元件。(6)CsMFT基因存在可变剪切,有 525 bp和689 bp 两个不同长度的转录本。研究推测,该研究所克隆的5个茶树CsPEBP家族成员均参与了调控茶树的开花过程和茶树对多种逆境的响应,为茶树开花调控相关研究奠定了基础。     

中国南瓜CmHSP70基因的克隆及表达分析

为了探究中国南瓜(Cucurbita moschata)热激蛋白70基因的功能,该研究采用转录组测序和RT PCR方法,从中国南瓜中分离获得3个HSP70基因的开放阅读框(ORF)全长,分别命名为CmHSP70 1、CmHSP70 2和CmHSP70 3,三者的序列长度分别为1 998、1 941和2 118 bp,编码666、647和706个氨基酸。蛋白序列分析显示,3个CmHSP70蛋白均属于亲水性蛋白,都含有典型的NBD和SBD保守结构域;CmHSP70 1蛋白含有信号肽和跨膜结构,亚细胞主要定位于内质网;CmHSP70 2蛋白和CmHSP70 3蛋白不含信号肽和跨膜结构,亚细胞主要定位于细胞质和叶绿体。同源比对和进化分析发现,3个CmHSP70蛋白与苦瓜、甜瓜和黄瓜的HSP70蛋白的相似性最高且遗传距离最近。qRT PCR分析显示,42 ℃处理能够诱导3个CmHSP70基因在根、茎、嫩叶和成熟叶中表达,并且表达量存在明显的组织特异性,成熟叶中基因的表达量最高;高温条件下,成熟叶中3个CmHSP70基因均能够在短时间内(处理0~2 h)响应热胁迫而大量表达,尤其是CmHSP70 2基因,推测该基因可能在中国南瓜热胁迫过程发挥重要的调节作用。该研究结果为深入了解HSP70基因功能以及阐明中国南瓜的耐热机制提供理论依据。     

中间锦鸡儿转录因子基因 CiNAC1的克隆及功能分析

NAC转录因子家族是植物特有的、最大的转录因子家族之一,在植物应答非生物胁迫和生长发育过程中有重要的功能。该研究通过PCR技术,克隆得到了中间锦鸡儿 CiNAC1基因1 066 bp的cDNA全长序列。生物信息学分析显示, CiNAC1基因的开放阅读框(ORF)为921 bp,编码306个氨基酸,推导的蛋白分子量为34.57 kD,等电点为8.35,是一种亲水性蛋白,N端具有保守的NAM结构域,具有26个磷酸化位点和7个糖基化位点。实时荧光定量PCR检测显示,中间锦鸡儿 CiNAC1基因表达受干旱、高盐、脱水、高pH诱导;亚细胞定位发现CiNAC1定位到细胞核中,这与它作为转录因子的功能是一致的;转CiNAC1基因拟南芥株系侧根数目显著多于野生型,根长也明显比野生型长。研究认为, CiNAC1基因可能与中间锦鸡儿响应逆境胁迫机制有关。     

蒺藜苜蓿MtbHLH148转录因子的克隆与转化及其功能分析

bHLH(Basic helix loop helix, bHLH)转录因子家族是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物生长发育和盐胁迫应答机制。该研究利用同源克隆的方法克隆蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的MtbHLH148基因,采用qRT PCR方法分析MtbHLH148基因在蒺藜苜蓿中的表达特性,构建超表达载体并通过农杆菌侵染法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),对转基因拟南芥的耐盐性相关功能进行分析研究。结果显示：(1)从蒺藜苜蓿中获得MtbHLH148基因,该基因cDNA全长1 343 bp,包含开放阅读框为603 bp,编码 201 个氨基酸,蛋白分子量22.7 kD,等电点为11.76;蛋白结构分析显示,该蛋白无跨膜结构域,无信号肽,为亲水性蛋白;含有精氨酸／赖氨酸残基的保守结构域和典型的bHLH结构域;二级结构以α 螺旋和无规则卷曲为主。(2)亚细胞定位表明,MtbHLH148蛋白定位在细胞核。(3)进化树分析表明,MtbHLH148与大豆(Glycine max)的亲缘性最近;启动子分析发现,该基因启动子区域含有光响应元件、MYB结合位点以及ABA应答元件ABRE,可能参与非生物胁迫。(4)qRT PCR分析发现,MtbHLH148基因在蒺藜苜蓿的茎中表达量最高,叶中表达量最低,且MtbHLH148基因受ABA(100 μmol/L)诱导并在盐胁迫(200 mmol/L NaCl)处理8 h内表达量上调,而在低温(4 ℃)处理时表达量明显下调。(5)成功构建超表达载体pCAMBIA3301 MtbHLH148并转化拟南芥获得16个抗性株系,经鉴定有12个过表达株系,其中表达量最高的转基因株系为OE8;对OE8株系耐盐性功能分析发现,转基因拟南芥植株的发芽率明显高于野生型,盐胁迫下转基因拟南芥的根长是野生型的1.5倍,表明其耐盐性得到了增强。研究表明,MtbHLH148基因可能在盐胁迫调节机制中具有一定的调控作用。     

‘潘那利’番茄碱性螺旋环螺旋转录因子基因的克隆与表达分析

碱性螺旋环螺旋(basic/Helix Loop Helix, bHLH)转录因子是植物最大的转录因子家族之一,其广泛参与植物逆境胁迫响应。该研究从野生‘潘那利’番茄(Solanum pennellii Correll)中成功克隆出bHLH转录因子基因SpbHLH89(Sol Genomics登录号Sopen04g001150),采用qRT PCR分析其在干旱胁迫下的表达模式,并利用异源表达初步分析其对非生物胁迫的响应。结果表明：(1)SpbHLH89编码区包含684 bp,编码227个氨基酸,具有典型的碱性螺旋环螺旋区,主要定位于细胞核中;进化树结果显示,SpbHLH89转录因子高度保守,与拟绒毛烟草NtbHLH94(Nicotiana tomentosiformis)存在高度相似性。(2)qRT PCR结果显示,SpbHLH89在‘潘那利’番茄的茎、叶和花中均有表达,其表达量受干旱胁迫诱导。(3)SDS PAGE与Western bloting结果显示,pET 30a SpbHLH89重组蛋白大小约为31 kD。(4)在盐胁迫(400 mmol/L NaCl)和干旱胁迫(600 mmol/L甘露醇)条件下,异源表达重组蛋白的E. coli BL21(DE3)重组菌生长速度提高,说明异源表达SpbHLH89转录因子基因可提高细菌对非生物胁迫的耐受性。     

呼伦贝尔黄花苜蓿MfMYB30基因的克隆及表达分析

该研究在呼伦贝尔黄花苜蓿(Medicago falcata L. cv. Hulunbuir)转录组测序基础上,通过RT PCR方法克隆获得了MfMYB30基因,并通过生物信息学和表达分析进行初步研究,为深入研究MfMYB30基因的功能和开发利用奠定基础。结果表明：(1)成功克隆获得呼伦贝尔黄花苜蓿MfMYB30基因,其ORF序列长为957 bp,编码318个氨基酸,相对分子质量为86.85 kD,理论等电点为5.11。MfMYB30蛋白为疏水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽序列。(2)系统进化分析表明黄花苜蓿MfMYB30蛋白与紫花苜蓿MsMYB4、拟南芥AtMYB30、木豆CcMYB30、蒺藜苜蓿MtMYB30和大豆GmMYB60聚为一个类群,亲缘关系较近。(3)实时荧光定量PCR结果显示,MfMYB30在黄花苜蓿模拟刈割不同天数后的相对表达量呈先降低后升高的趋势,在刈割7 d后相对表达量达到峰值。(4)通过在拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该蛋白定位于细胞核。研究推测,MfMYB30基因可能在黄花苜蓿刈割或放牧胁迫响应过程中发挥重要调控作用。     

核桃JrsHSP17.3基因克隆及温度胁迫响应模式分析

通过分析核桃（Juglans regia）转录组,鉴定获得核桃热激蛋白家族sHSP17.3基因的全长cDNA序列,命名为JrsHSP17.3。JrsHSP17.3基因开放读码框474 bp,编码产物含157个氨基酸,分子量为17.64 kD,理论等电点为5.35。为了研究该基因表达的组织特异性及温度响应模式,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,对高温和低温胁迫下JrsHSP17.3基因在根、茎、叶中的转录水平进行分析。结果显示,JrsHSP17.3基因在不同组织中均有表达;经高温（36 ℃～52 ℃）和低温（16 ℃～6 ℃）处理后,JrsHSP17.3基因均可被显著诱导,其中12 ℃胁迫1 h表达最高,为对照（非处理情况）的142.02倍。研究表明核桃JrsHSP17.3基因能够响应冷热温度胁迫,为进一步研究JrsHSP17.3基因的抗寒耐高温特性奠定基础。     

芥菜型油菜WRKY71转录因子基因家族的鉴定及表达分析

WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物生长发育及逆境胁迫中起重要作用。该研究在芥菜型油菜基因组概览测序的基础上,采用RT PCR技术克隆了4个芥菜型油菜WRKY71s基因,分别命名为BjuWRKY71 1 4。生物信息学分析表明,BjuWRKY71 1 4基因开放阅读框（ORF）分别为822、840、834和855 bp,分别编码273、279、277和284个氨基酸,预测分子量和等电点分别为30.80、27.11、31.58、32.18 kD和7.75、9.08、8.35、7.76。系统进化树分析表明,BjuWRKY71 1 4与白菜WRKY71转录因子相似性最高。亚细胞定位预测分析结果显示,BjuWRKY71s蛋白均定位于细胞核。这4个基因分别定位到芥菜型油菜的A09、B04、A07和scaffold144上。qRT PCR结果表明,4个BjuWRKY71s基因在高盐、脱落酸和低温胁迫下都有响应。在盐胁迫下, BjuWRKY71 3的表达量呈持续上升趋势,而其他3个基因在6 h时表达量达到最大,然后降低;在ABA处理下,BjuWRKY71s基因于6 h时表达量最大,随后逐步降低;低温处理后,BjuWRKY71s基因受低温诱导都显著上调表达。BjuWRKY71 4在该研究的3个胁迫条件下响应最为敏感。研究结果为进一步探讨该基因家族对芥菜型油菜逆境调控机制奠定了基础。     

黄毛草莓FnMYB24转录因子基因和启动子的克隆及表达分析

该研究以黄毛草莓(Fragaria nilgerrensis Schltdl.)为材料,采用RT PCR技术克隆了黄毛草莓FnMYB24基因的cDNA和启动子序列。生物信息学分析表明,FnMYB24的cDNA序列长为1 033 bp(GenBank登录号为MN879283),其开放阅读框(ORF)长为609 bp,编码202个氨基酸,含有1个保守的MYB_DNA binding结构域。同源分析结果显示,黄毛草莓FnMYB24基因编码的氨基酸序列与森林草莓(Fragaria vesca)编码的氨基酸相似性较高;同时进一步克隆了该基因编码起始位点上游长度为718 bp启动子序列(GenBank登录号为MN879285),预测该序列包含激素响应元件、光调控元件等多个顺式作用元件。通过构建pFnMYB24∷GUS表达载体进行烟草瞬时转化,发现pFnMYB24启动子具有转录活性且能够驱动FnMYB24基因表达。实时荧光定量PCR结果显示：抗病品种黄毛草莓和易感病栽培品种‘妙香3号’的叶片接种胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)后MYB24基因表达量均有上调,但‘妙香3号’的MYB24表达量始终低于黄毛草莓的表达量;SA处理后2个草莓品种的MYB24表达量均高于对照组,表明MYB24基因受水杨酸(SA)的诱导表达。研究表明,草莓MYB24基因可能参与调控抗炭疽病,为进一步研究MYB24基因在草莓抗炭疽病中的功能奠定了基础。     

毛果杨HDA901基因的克隆和表达分析

该实验克隆了毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因HDA901的编码序列,并进行生物信息学、亚细胞定位和盐胁迫表达分析。序列分析表明,HDA901开放阅读框为1 245bp,编码1个由414个氨基酸残基组成的蛋白质,等电点为5.77;毛果杨HDA901与其他植物同源蛋白具有一段保守序列,在进化上与拟南芥AtHDA14亲缘关系较近。启动子分析表明,毛果杨HDA901基因启动子序列包含ACE、ABRE、HSE和TC-rich repeats等多个与逆境相关的顺式作用元件。亚细胞定位分析表明,毛果杨HDA901蛋白在细胞核和细胞质中无分布,可能位于线粒体或穿梭于线粒体和叶绿体之间。实时荧光定量PCR结果显示,毛果杨HDA901基因表达受盐胁迫调节,在盐胁迫下,根和茎中HDA901基因表达受抑制;叶中HDA901基因表达受诱导。研究表明,毛果杨HDA901基因参与盐胁迫应答反应。     

沙鞭PvDREB基因克隆与表达特异性分析

基于沙鞭的三代转录组数据,该研究利用PCR技术克隆DREB基因,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式以及在20%PEG-6000模拟干旱胁迫处理下的表达特征,以探讨干旱胁迫下沙鞭DREB转录因子的功能和作用,为揭示PvDREB基因响应沙鞭的耐旱分子机制奠定基础。结果表明：(1)成功克隆获得一个沙鞭DREB基因,命名为PvDREB;PvDREB基因编码区长度831 bp、编码276个氨基酸,含有典型的AP2转录因子保守结构域;PvDREB蛋白是亲水性蛋白,不具有信号肽结构,存在跨膜结构和可能的糖基化及磷酸化位点。(2)系统进化分析显示,PvDREB基因与毛竹的DREB亲缘关系较近。(3)亚细胞定位预测表明,PvDREB蛋白定位于线粒体和细胞核中。(4)qRT-PCR显示,沙鞭根、茎和叶中PvDREB均可诱导表达但差异较大,且在茎中表达量最高,叶中次之,根中最低,具有明显的组织特异性;20%PEG-6000模拟干旱下,PvDREB基因在叶中的表达量随干旱胁迫时间增加而增加,12 h时达到最高,之后逐渐下降。研究推测,沙鞭PvDREB基因受干旱胁迫诱导表达,且...     

棉花抗逆基因GhAREB4的克隆及功能分析

AREBs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应,在植物抵御各种逆境胁迫中起着非常重要的作用。该研究经序列电子拼接克隆了陆地棉GhAREB4基因,该基因全长1 784bp,其开放阅读框为1 227bp,编码408个氨基酸,预测分子量为44.3kD,等电点为8.88。蛋白结构预测发现,该蛋白二级结构中含有bZIP基因家族的保守结构域。系统进化树分析表明,GhAREB4与可可的AREB转录因子同源性最高。绿色荧光蛋白亚细胞定位分析表明,GhAREB4蛋白分布在细胞核内。qRT-PCR分析表明,GhAREB4基因在花中的表达量最高;且GhAREB4基因表达受到干旱、高盐、低温、脱落酸(ABA)等处理的诱导,其可能调控棉花对非生物逆境的耐性响应。研究结果为进一步研究该基因对棉花耐逆调控机制奠定了基础。     

蒙古冰草AmWRKY1-like基因克隆及表达分析

基于转录组测序数据,该研究采用PCR扩增方法从蒙古冰草中克隆AmWRKY1-like的全长cDNA,并对其进行了生物信息学和亚细胞定位分析,为深入研究AmWRKY1-like在蒙古冰草干旱胁迫响应中的调控作用提供理论基础。结果发现:成功克隆得到了AmWRKY1-like基因,其开放阅读边框(ORF)为1182 bp、编码393个氨基酸,含有典型的WRKY转录因子保守结构域;qRT-PCR表明,在自然干旱和15%PEG-6000模拟干旱下,蒙古冰草叶片中AmWRKY1-like均可诱导表达,较对照呈下调表达趋势;亚细胞定位表明,AmWRKY1-like基因在细胞核中特异表达。     

Cloning and Characterization of Functional Trehalose-6-Phosphate Synthase Gene in Maize

Trehalose is a non-reducing disaccharide of glucose that functions as a compatible solute in the stabilization of biological structures under heat and desiccation stress in bacteria, fungi, and some “resurrection plants”. In the plant kingdom, trehalose is biosynthesized by trehalose-6-phosphate synthase (TPS) and trehalose-6-phosphate phosphatase (TPP). Over-expression of exogenous and endogenous genes encoding TPS and TPP is reported to be effective for improving abiotic stress tolerance in tobacco, potato, tomato, rice, and Arabidopsis. On the basis of bioinformatics prediction, we cloned a fragment containing an open reading frame of 2,820 bp from maize, which encodes a protein of 939 amino acids. Phylogenetic analysis showed that this gene belongs to the class I subfamily of the TPS gene family. Analysis of conserved domains revealed the presence of a TPS domain and a TPP domain. Yeast complementation with TPS and TPP mutants demonstrated that this protein has the activity of trehalose-6-phosphate synthase. Semi-quantitative RT-PCR and real-time quantitative PCR indicated that the expression of this gene is upregulated in response to both salt and cold stress.     

天山雪莲LEA14基因克隆及功能分析

从天山雪莲叶片低温诱导的EST文库中获得了1个胚胎发育晚期丰富蛋白基因(LEA)cDNA全长序列。序列分析表明,该基因含有1个468bp编码155个氨基酸的开放阅读框。NCBI保守域预测此蛋白属于LEA_2家族,命名为SiLEA14。系统进化分析表明,该蛋白与北柴胡的LEA-2蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,SiLEA14表达量在低温、盐和干旱胁迫条件下迅速升高。亚细胞定位结果表明,SiLEA14蛋白定位于细胞核中。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,测定并分析转基因植株在冷冻和盐胁迫处理下的生理指标,结果表明,SiLEA14基因在烟草中的过量表达提高了烟草的抗冻和耐盐能力。     

鹅掌楸DHHC型锌指蛋白家族基因的克隆及表达分析

棕榈酰化修饰是一种最普遍且唯一可逆的翻译后脂质修饰方式,赋予蛋白质多样化的生理功能。DHHC( Asp-His-His-Cys)蛋白家族是一类与棕榈酰化修饰相关的蛋白,多数DHHC蛋白家族成员具有蛋白质酰基转移酶( protein S-acyltransferase,PAT)活性。该研究以鹅掌楸叶芽为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆获得了3个鹅掌楸DHHC蛋白家族基因cDNA全长,命名为LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23。序列分析结果表明：LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23基因全长分别为1933、2592、2217 bp,各包含1332、1839、1662 bp的开放阅读框( Open Reading Frame,ORF),编码433、612、533个氨基酸,预测蛋白分子量分别为40.04、67.3、60.57 kDa,理论等电点为9.15、9.03、7.29。3个基因编码的蛋白均有4个跨膜区,并且都在跨膜域( transmembrane domain, TM) TM2和 TM3之间存在一个 DHHC 蛋白家族典型的 DHHC-CRD 结构域。同源性分析表明：鹅掌楸LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23编码的氨基酸序列与其他植物中预测的PAT具有较高的相似性。利用荧光定量PCR技术检测3个基因在鹅掌楸不同组织中的表达特性,发现3个基因在不同组织中均有表达,但表达量具有明显区别。同一家族基因表达模式的变化表明其功能非冗余。该研究结果将为鹅掌楸生长发育与形态建成,以及逆境响应信号传导等相关基因的调控研究提供了参考。     

The wheat gene <Emphasis Type="Italic">TaST</Emphasis> can increase the salt tolerance of transgenic <Emphasis Type="Italic">Arabidopsis</Emphasis>

On the basis of the results of gene chip analysis of the salt-tolerant wheat mutant RH8706-49 under conditions of salt stress, we identified and cloned an unknown salt-induced gene TaST (Triticum aestivum salt-tolerant). Real-time quantitative PCR analysis showed that the expression of the gene was induced by salt stress. Transgenic Arabidopsis plants overexpressing the TaST gene showed higher salt tolerance than the wild-type controls. Subcellular localization studies revealed that the protein encoded by this gene was in the nucleus. In comparison with wild-type controls, transgenic Arabidopsis plants accumulated more Ca²⁺, soluble sugar, and proline and less Na⁺ under salt stress. Real-time quantitative PCR analysis showed that Arabidopsis plants overexpressing TaST also showed increased expression of many stress-related genes. All these findings indicated that TaST can enhance the salt tolerance of transgenic Arabidopsis plants.