棉花曲叶病毒启动子在根癌土壤杆菌中的表达活性

棉花曲叶病毒（CLCuV)是一种单链DNA病毒,属于双生病毒亚组Ⅲ,检测了双生病毒双向启动子在根癌土壤杆菌（Agrobacterium turnefaciens(Smith et Townsend) Conn()LBA4404中的活性,研究发现在根癌土壤杆菌中CLCuV双向启动子的互补链启动子活性高于病毒链启动子,其在土壤杆菌中驱动的GUS活性为CaMV 35S启动子驱动的GUS活性的2倍,同时,通过对一系列CLCuV双向启动子的互补链5′端缺失体在土壤杆菌中的活性分析表明－287bp上游可能存在一负调控元件,该元件的缺失可使启动子活性达全长启动子的4倍之多,还讨论了CLCuV互补链启动子所亿的其他顺式元件的功能。     

棉花曲叶病毒大基因间区启动子在宿主植物中的表达活性

棉花曲叶病毒(CLCuV)是一种单链DNA病毒,属于双生病毒亚组Ⅲ.为了研究其基因组大基因间区(LIR)的功能,以CLCuV侵染的烟草叶片组织总DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增LIR并插入克隆载体.将LIR分别以互补链及病毒链基因转录方向与gus报告基因和nos终止子融合,构建了植物表达载体.通过农杆菌介导的方法转化烟草并测定转化植株的GUS活性,实验结果表明,LIR在互补链基因方向具有强启动子活性,GUS平均活性是CaMV 35S启动子的5～6倍,单株最高的GUS活性达到CaMV 35S启动子的10倍;组织化学定位证实其在叶肉及维管组织均有活性.LIR在病毒链基因方向的启动子活性较低.报道了CLCuV来源的分离的LIR在互补链基因方向可作为一种新型的强启动子元件应用于植物遗传操作.     

从水稻细胞质型果糖-1,6-二磷酸酶启动子上游中去除93 bp可以彻底改变其表达模式

细胞质型果糖-1,6-二磷酸基因ATG上游1 195bp侧翼序列可调控GUS基因在水稻(Oryza sativa L.)中特异性表达,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式元件.为了研究其调控特异表达的顺式元件,对启动子5′端进行了一系列的缺失,得到4种与GUS基因融合的植物表达载体,通过基因枪法转入水稻.结果表明,自启动子5′端-1 195 bp缺失至-1 102 bp时,GUS基因由叶肉细胞特异性表达变为组成型表达,且表达活性有所提高,推测在该区段中存在调控叶肉细胞特异性表达的顺式元件.进一步缺失仍然保持组成性表达的模式,即在转化株的根、茎和叶中的所有细胞中均有表达,同时启动子活性有所提高.这一结果暗示该启动子具有很大的应用潜力.     

从水稻细胞质型果糖—1，6—二磷酸酶启动子上游中去除93bp可以彻底改变其表达模式

细胞质型果糖_1,6_二磷酸基因ATG上游 1195bp侧翼序列可调控GUS基因在水稻 (OryzasativaL .)中特异性表达 ,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式元件。为了研究其调控特异表达的顺式元件 ,对启动子 5′端进行了一系列的缺失 ,得到 4种与GUS基因融合的植物表达载体 ,通过基因枪法转入水稻。结果表明 ,自启动子 5′端 - 1195bp缺失至 - 110 2bp时 ,GUS基因由叶肉细胞特异性表达变为组成型表达 ,且表达活性有所提高 ,推测在该区段中存在调控叶肉细胞特异性表达的顺式元件。进一步缺失仍然保持组成性表达的模式 ,即在转化株的根、茎和叶中的所有细胞中均有表达 ,同时启动子活性有所提高。这一结果暗示该启动子具有很大的应用潜力。     

棉花曲叶病毒反式作用因子AC2的功能初探

有关非洲木薯花叶病毒（ACMV）、番茄金色花叶病毒（TGMV）的研究表明,双生病毒编码的反式作用因子AC2反式激活病毒链基因启动子的瞬时表达。以棉花曲叶病毒（CLCuV)侵染的烟草叶片组织总的DNA为模板,通过聚合酶反应扩增CLCuV的AC2基因片段并插入克隆载体。将AC2置于CaMV35S启动子下构建了瞬时表达载体。通过基因他法将质粒载体导入烟草（Nicotiana tabacumL.)和棉花（Gossypium hirstumL.)叶片细胞中进行瞬时表达,结果表明,在反式作用因子AC2的激活下,病毒链基因启动子驱动的GUS活性明显增强,然而激活后的病毒链基因启动子的活性仍低于互补链基因方向启动子;其表达方式与互补链基因启动子相似,即在叶肉及叶脉维管组织均有较高的活性。还探讨了AC2在土壤杆菌介导的转基因植物中的表达行为。     

竹节花黄斑驳病毒启动子的缺失分析及功能

竹节花黄斑驳病毒(CoYMV)是侵染单子叶植物竹节花的一 种双链环状DNA病毒,它的启动子可介导外源基因在烟草韧皮部特异表达。为了研究其组织 特异性表达的最佳启动子区域,对CoYMV启动子进行了5′端五种不同长度的缺失分析,用不同长度的启动子片段与GUS基因及NOS3′端转录中止序列构建了全长启动子及5 个缺失启动子序列的六个嵌合GUS基因植物表达载体。利用农杆菌将上述嵌合基因转化烟草 外植体后,每种表达载体都获得了一批转基因烟草植株。转化再生烟草植株的PCR分析、GUS 酶活测定及GUS组织染色的结果表明六种类型的嵌合基因已整合到烟草染色体中,并有五种 表达出GUS活性。缺失到870bp的启动子比全长启动子(1040bp)的活性约高78%,870bp比585bp启动子介导的GUS活性略高但差别不明显,缺失到447和232时GUS活性有明显下 降,但仍具有韧皮部特异表达的特性。当缺失到TATA box附近的44bp时启动子丧失组织特 异性,GUS活性也降低到测不出来的水平。以上结果表明CoYMV启动子从转录起始位点上游 870bp～230bp及232bp下游区分别与启动子的活性和韧皮部组织特异性密切相关,870bp上游可能存在一个负调控序列,所以该启动子的活性和组织特异性的最佳调控区应在87 0bp或585bp的下游区。CoYMV启动子与35S启动子驱动GUS基因在烟草中表达的活性相比, 前者为后者的70%左右,考虑到前者仅在韧皮部细胞表达而后者为组成型表达,所以CoYMV启 动子在韧皮部的活性可能与35S启动子相当或更高。CoYMV启动子在其它转基因植物中驱动外 源基因表达的特点正在研究中。     

辽宁碱蓬SlCMO基因盐胁迫表达分析及盐诱导启动子鉴定

胆碱单加氧酶（choline monooxygenase, CMO）是合成甜菜碱的关键酶,甜菜碱在植物抵抗渗透胁迫中起着重要的作用。本研究室前期克隆了盐生植物辽宁碱蓬CMO（Suaeda liaotungensis CMO）基因及启动子。本研究对SlCMO基因在盐胁迫下的表达及盐诱导启动子进行分析。qRT-PCR分析SlCMO基因在辽宁碱蓬不同器官及盐胁迫下的表达,结果表明,SlCMO基因在根、茎、叶中均有表达,其中茎、叶中的表达量较高,SlCMO基因在根、茎、叶中的表达均受盐胁迫诱导。5′端缺失分析SlCMO启动子的盐诱导区段,结果表明,pC5（-267~+128 bp）是SlCMO启动子的盐诱导功能区段,推测pC5调控SlCMO 基因的盐诱导表达。本研究为SlCMO 基因表达调控研究奠定基础,也为植物抗盐基因工程提供可用的启动子。     

mas双向启动子

农杆菌Ti质粒上存在甘露碱合成酶 (mannopinesynthase)基因mas1′和mas2′ ,两基因之间 479bp的间隔区即为由mas1′和mas2′基因共用的双向启动子 .由于mas启动子长度较短 ,且在各种类型的植物中能够高效表达 ,所以可用于许多植物基因表达载体的构建 .为确定mas1′启动子不同区段的作用 ,将不同缺失长度的mas1′启动子与GUS报告基因融合 .在转基因烟草中发现 ,随着mas1′启动子片段的缩短 ,GUS活性表达水平反而提高 ,但当缺失至 - 5 8时便没有了活性 .表明有多个DNA元件调节mas1′启动子的活性 .进一步分析发现 ,在- 10 0～ - 5 8之间存…     

油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因启动子区的克隆及初步的功能分析

利用双链接头介导PCR的染色体步行技术, 克隆了油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因上游1.6 kb的调控区域(GenBank登录号为AF472487). 序列分析表明, 该片段中含有种子萌发特异性序列及维管束特异性序列. 将其全长片段及5′端不同长度的缺失片段与gus(uidA)基因连接构建植物表达载体, 转化烟草. GUS组织化学染色表明, 全长1.6 kb片段具有较强的启动子活性. GUS染色主要分布在细胞迅速增生的部位及维管束组织中. 启动子缺失试验的GUS染色结果表明, -1610~-1030 bp区段的缺失使gus基因的表达明显变弱, 推测该区段含有启动子的正调控元件; -1030~-902 bp可能存在强烈抑制基因表达的负调控元件; -902~-19 bp的片段亦可驱动gus基因的高水平表达.     

甜瓜黄瓜素基因启动子表达载体的构建及分析

该研究构建了由黄瓜素基因5′端310bp启动子序列驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的植物表达载体pPZP-CGN,通过花粉管通道法将植物表达载体pPZP-CGN导入甜瓜,并采用荧光法定量测定转基因植株中GUS活性。结果显示,gus基因在果实中高表达,而在根、茎、叶等组织中表达活性很低,表明黄瓜素基因上游310bp启动子具有指导外源基因在果实中高效特异表达的特性。     

香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区的克隆及其功能初探

根据本实验室所获得的香蕉果实特异性ACC合酶cDNA序列,以改进的接头连接PCR方法通过两次步行从香蕉基因组中分别扩增并克隆了其基因5′旁侧区近端1.2kb和远端1.6kb的片段。通过拼接,构建出含有2505bp启动子区和转录起始位点下游86bp的共2591bp的基因5′旁侧区片段;其启发性动子区中34至28为推测的TATA盒序列,158至146为推测的CCAAT盒,与其它植物基因启动子结构相类似。将2.5kb启动子片段与β-葡糖苷酸酶(GUS)基因编码序列融合,用基因枪法将构建的嵌合基因转入香蕉叶、根和果实的细胞后,只在果实细胞中观察到报告基因的瞬时表达,从功能上证明了此25kb的启动子片段具有指导报告基因在香蕉果实中特异性表达的作用。同时构建5个含不同5′端缺失启动子与GUS融合基因的表达载体。瞬时表达结果表明可能负责果实特异性表达的调控区存在于转录起始位点至-1111的启动子区中,而在-1111至-608区间可能存在一个正控制区。     

ggpps 5′-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的：研究栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs）基因启动子的活性;方法：从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5′-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果：本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5′-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论：ggpps基因的5′-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5′-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础。     

p53过表达抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性

NKX3.1是前列腺特异表达的同源盒基因,在前列腺癌的发生发展中起重要作用,而在前列腺癌进展中常会发生p53的基因突变.为研究两者之间的关系,构建NKX-3.1启动子(1 040bp)-荧光素酶报告基因重组质粒（pGL3-1040）及其缺失突变体,瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP.通过荧光素酶表达活性分析,检测p53过表达对NKX3.1启动子活性的影响.结果表明：p53在LNCaP细胞中过表达可明显抑制NKX3.1启动子活性;RT-PCR及Western印迹检测p53过表达对NKX3.1表达的影响.结果表明,p53过表达可以明显抑制同源盒基因NKX3.1的表达.通过TRANSFAC软件分析,在NKX3.1基因上游-526至-507区存在一个p53反应元件的5′核心序列.缺失pGL3-1040中的p53反应元件核心序列并不能消除p53对NKX3.1启动子的抑制作用,表明p53不是通过p53反应元件直接抑制NKX3.1启动子活性.进一步通过5′缺失突变分析,发现NKX3.1启动子-140～+8 bp区仍受p53负调控.此148 bp区域中含有一个Sp1和一个CREB元件,瞬时共转染Sp1表达载体或CREB表达载体的结果表明,p53并不是通过与Sp1或CREB相互作用对NKX3.1启动子发挥抑制作用的.上述结果表明,p53过表达可以抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性,下调NKX3.1基因的转录,其调控机制有待进一步研究.     

小鼠组蛋白H3K4甲基化酶Smyd3启动子荧光素酶报告载体的构建与活性分析

为研究小鼠(Mus musculus)组蛋白H3 K4甲基化酶基因Smyd3转录调控的分子机制,本研究首先通过PCR的方法克隆了5条不同长度的Smyd3启动子5’端缺失片段,与pMD19-T载体连接后,双酶切克隆入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,构建Smyd3启动子-pGL3-Basic报告基因重组质粒,瞬时转染HEK293细胞48 h后采用双报告基因检测试剂盒检测Smyd3启动子各缺失片段的相对荧光活性.结果表明,本研究成功构建Smyd3启动子5’端缺失片段-pGL3-Basic荧光报告基因重组质粒,所构建的启动子重组子转染组与阳性对照组相比表现出荧光活性,并且pGL3-Smyd3-4的荧光活性最强,是其他的2至4倍左右,pGL3-Smyd3-5的荧光活性最弱.本研究初步确定Smyd3基因的启动子核心区域可能位于-533～-42bp之间,在-2026～-533 bp之间可能存在启动子负调控序列.     

拟南芥鼠李糖合成酶基因AtRHM1启动子区葡萄糖应答调控元件的鉴定

植物中,UDP-L-鼠李糖是细胞壁骨架的主要成分,由鼠李糖合成酶催化底物UDP-α<,-D->葡萄糖合成.本实验从拟南芥基因组中分离了鼠李糖合成酶基因AtRHM1 1058bp的启动子序列并对启动子5'端进行了不同长度的缺失.将全长启动子及不同缺失启动子与GUS报告基因进行融合后转化野生型拟南芥,获得了一系列转基因植株.启动子缺失分析结果表明,AtRHM1基因在转录水平上受葡萄糖的诱导,参与葡萄糖应答反应的顺式调控元件位于启动子的-931 bp～-752bp区域.     

番茄Lehsp23.8启动子的热诱导表达调控序列鉴定

番茄线粒体小分子热激蛋白(Lehsp23.8)启动子是典型的热诱导启动子。为了研究热激条件下该启动子的调控序列,本研究将不同长度的Lehsp23.8启动子序列与gus基因融合,构建5′缺失植物表达载体。然后用农杆菌介导法转化烟草,PCR及Southern blotting结果表明融合基因已经整合到烟草基因组中。GUS组织化学染色结果表明:不同长度Lehsp23.8启动子转基因植株热激处理后,在幼苗根、茎、叶以及花和果实中均表现出GUS活性,只是染色强弱有差异。叶片中GUS荧光活性测定结果表明:在热激处理条件下,565bp的Lehsp23.8启动子介导的GUS表达最强;而255bp的Lehsp23.8启动子介导的GUS表达最弱。说明Lehsp23.8启动子中255bp的序列即能满足该启动子的热激表达,-565bp～-255bp之间存在明显的增强子元件,而-871bp～-565bp之间的片段具有一定的抑制作用。     

RU5区对BFV3026基因表达的调控

以牛泡沫病毒(Bovine foamy virus, BFV)中国株BFV3026原病毒DNA为材料,构建R区系列缺失质粒, 通过对其转染细胞中RT水平及对缺失质粒与luc报告质粒共转染细胞中萤火虫荧光素酶活性的测定,确立U5区对于BFV3026两类启动子LTR和IP均具有负调控作用;同时将带有不同R区的BFV3026结构基因片段克隆于异源启动子CMV之下,通过对其转染细胞293T中RT酶活性的测定,确立R区对于病毒结构基因pol的表达具有一定的调节作用,并将其功能区域初步界定在R区5′端100bp内.     

西瓜果实特异启动子WSP功能区域的初步定位

西瓜AGPase的大亚基基因wml1的 5′端上游 15 73bp序列 ,是一个果实特异性启动子 (命名为WSP)。根据WSP内部酶切位点 ,获得了 3个不同 5′端缺失的启动子片段 (长分别为 12 0 1bp、898bp、795bp) ,并构建成植物瞬间表达载体 ,与含WSP的瞬间表达载体一起用基因枪的方法转入西瓜叶、茎、花及不同发育期果实中。瞬时表达结果表明 ,15 73bp、12 0 1bp、898bp的片段均能指导GUS基因在西瓜果实和花中特异性表达 ,但是表达强度和表达时期有所不同 ,795bp的片段不能指导GUS基因表达。推测在 180bp 5 5 1bp之间可能存在促进外源基因在果实发育后期表达的顺式作用元件 ,而果实特异调控区域可能位于 85 4bp 95 7bp之间。     

绵羊高硫角蛋白KAP1.3基因启动子活性分析

旨在研究高硫角蛋白基因启动子及相关调控序列的表达活性。以绵羊基因组为模板,克隆KAP1.3基因启动子序列,对其进行5个系列缺失片段pGL4.10表达载体构建,将不同重组质粒转染小鼠成纤维细胞,通过裂解细胞测定其荧光值方法来检测启动子的表达活性。结果显示,除KAP1.3-P5片段其余片段均具有表达活性,其中KAP1.3-P1片段表达活性最高,而缺失-944至-707处的KAP1.3-P2对启动子的活性没有显著影响,但缺失-944至-394处KAP1.3-P3片段对启动子活性影响比较大,从P3和P4的结果中可以看出,虽然两个片段都缺失了转录因子bHLH的结合位点,但P4的活性比P3高出约20%,由此推测在-394至-195之间可能存在一个负调控元件,在-195和-4之间可能存在一个增强元件,但具体的调控元件还需要再进行细致地分析,优化出活性最高且特异性不变的启动子片段。     

人乳铁蛋白cDNA 基因乳腺表达载体的构建与鉴定

为了构建人乳铁蛋白基因 (hLF) 的乳腺表达载体并验证其在乳腺细胞中的表达情况,本载体以山羊β-casein基因上游包括启动子、外显子1、内含子1、部分外显子2作为5′端调控序列,下游包括部分外显子7、内含子7、外显子8、内含子8、外显子9及3′部分基因组片段作为3′端调控序列,长度分别为6.2 kb和7.1 kb,将hLF基因 (目的基因) 和Neo基因 (筛选标记) 分别插入到5′端调控序列和3′端调控序列的下游,构建成pBC1-hLF-Neo载体,其全长为25.348 kb。为了检测该载体的生物学