FtMYB1转录因子调控苦荞毛状根黄酮醇合成的机理研究

R2R3-MYB转录因子在植物类黄酮合成中起重要的调控作用。本研究从川荞1号中克隆获得一个R2R3-MYB家族基因FtMYB1,酵母转录激活分析显示其具有转录激活活性,激素处理下的表达模式分析显示,FtMYB1基因能够被茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导表达。在苦荞毛状根中过表达FtMYB1基因,结果表明转基因毛状根株系中总黄酮和芦丁含量显著低于野生型,且在黄酮醇合成途径下游分别编码黄酮醇合酶(FLS)和鼠李糖基转移酶(RT)的FLS和RT1基因表达量在转基因株系中显著降低,表明FtMYB1可能通过调控FLS和RT1的表达来抑制黄酮醇的生物合成。     

苦荞R2R3-MYB转录因子调控原花青素生物合成的研究

基于苦荞花期转录组数据,该研究筛选并克隆获得一个黄酮代谢相关的MYB类转录因子,并命名为FtMYB23。该基因ORF框长879bp,编码292个氨基酸;系统进化树分析显示,FtMYB23与SG5-MYB亚家族成员聚为一簇,属于典型的R2R3-MYB型转录因子。β-半乳糖苷酶滤纸分析表明,其具有转录激活活性。FtMYB23过表达转基因拟南芥株系的表型分析表明,3个阳性株系的种皮颜色均呈现出比野生型更深的褐色,其叶中原花青素含量均极显著增加(P 0.01),分别为野生型的4.68、3.5和2.8倍。qRT-PCR分析表明,转基因拟南芥中黄酮合成相关的AtCHS、AtCHI、AtF3H、AtF3′H、AtFLS、AtDFR和AtBAN等基因的表达量显著升高(P 0.05),而AtTT12的表达量极显著降低(P 0.01)。研究认为,FtMYB23作为典型的Subgroup5-MYB(SG5-MYB)激活型转录因子,通过促进黄酮合成途径早期关键酶基因的表达,从而提高原花青素的合成与积累。     

木薯MeMYC2.2基因耐低温功能研究

MYC2（MYeloCytomatosis）转录因子是植物应对逆境胁迫过程中茉莉酸信号传导相关的核心转录因子。本研究旨在初步分析木薯MeMYC2.2基因在低温胁迫响应中的功能。利用生物信息学分析木薯MeMYC2.1和MeMYC2.2基因的结构及其编码蛋白的理化性质;通过定量PCR分析了上述2个基因在木薯组培苗叶片中对低温胁迫的响应;通过转基因拟南芥研究MeMYC2.2的抗冻功能。木薯组培苗叶片中2个MeMYC2基因的表达均在低温胁迫早期被诱导,其中,与MeMYC2.1相比,MeMYC2.2差异表达更显著。MeMYC2.2蛋白主要定位于细胞核中,且在酵母中具有明显转录自激活功能,表明该蛋白具有转录因子特性。与野生型相比,过表达MeMYC2.2的转基因拟南芥抗冻能力显著提高。在低温处理下,CBF3基因在转基因拟南芥中的表达量要明显高于其在野生型的表达量,但另外3个CBF基因在转基因拟南芥中的表达量明显下降。木薯MeMYC2.2的表达受低温和茉莉酸调控,可以提高植物的抗冻性,且可能影响CBF基因对低温的响应。本研究为进一步利用MeMYC2基因改良木薯的低温耐受性奠定了理论基础。     

青杄转录共激活因子PwMBF1c的功能研究与验证

克隆通过青杄干旱转录组筛选到的差异候选基因PwMBF1c,对其生物学功能进行分析和验证,以期能够解析青杄的耐旱机理,并为培育优良抗逆林木品种提供基因资源。利用RT-qPCR技术分析PwMBF1c对干旱、高温、低温及激素处理的响应。瞬时转化烟草叶片和洋葱表皮细胞检测PwMBF1c的亚细胞定位。利用酵母单杂验证PwMBF1c的转录活性。在拟南芥和马铃薯体系中验证了PwMBF1c抗旱应答的功能。PwMBF1c主要在成熟叶中表达,其转录水平受干旱、高温、水杨酸（SA）诱导上调;PwMBF1c的C端具有转录激活活性,而N端和全长不具有转录活性;PwMBF1c定位于细胞膜、细胞质和细胞核;过表达PwMBF1c显著提高了拟南芥和马铃薯的耐旱性。干旱胁迫下,与对照组Col-0和VC相比,过表达拟南芥株系PwMBF1c-L1和PwMBF1c-L2存活率更高,叶绿素含量较高,MDA含量较低;在PEG处理后,与野生型马铃薯Y5相比,过表达PwMBF1c显著提高了苗高。PwMBF1c的表达水平受干旱等多种逆境和激素的诱导,PwMBF1c主要定位于细胞膜、细胞质和细胞核,且该蛋白的C端具有转录激活活性。PwMB...     

拟南芥AtUNE12基因的耐盐功能初探

bHLH转录因子家族成员在植物生长发育、生理代谢及非生物胁迫响应过程中起重要作用。本研究选取拟南芥抗逆相关bHLH转录因子家族中AtUNE12基因为研究对象,对其进行耐盐功能初探。首先构建AtUNE12基因的植物过表达载体（pROKⅡ-AtUNE12）,通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,利用qRT-PCR技术检测获得T₃代AtUNE12过表达转基因植株。在盐胁迫下,分析过表达AtUNE12与野生型拟南芥长势、根长及鲜重;比较过表达AtUNE12与野生型植株的电解质渗透率、失水率、MDA含量、POD与SOD活性及H₂O₂含量,鉴定AtUNE12基因是否具有耐盐能力。结果表明：过表达AtUNE12基因降低了拟南芥植株的失水率、电解质渗透率及MDA含量,保护细胞膜结构的完整性;增强了POD与SOD活性,降低了拟南芥植株内的H₂O₂含量,进而增强拟南芥植株的ROS清除能力,从而提高拟南芥的耐盐能力。     

拟南芥AtDAD1超量表达植株对H2O2抗性的研究

构建拟南芥AtDAD1超量表达载体,以农杆菌介导的方法转化拟南芥哥伦比亚生态型,比较AtDAD1超量表达植株和野生型植株表现型的差异,以及两者对H₂O₂抗性的不同。实验显示,AtDAD1转基因拟南芥生长较野生型拟南芥更为强壮,对高浓度H₂O₂有较强的耐受力。测定两者糖含量,发现AtDAD1转基因拟南芥叶片糖的含量明显高于野生型拟南芥叶片。以上结果表明,AtDAD1基因可能参与植物生长发育,并可能在拟南芥抵抗凋亡的过程中发挥重要的作用。     

光信号对AmRosea1过表达84K杨花青素合成及基因表达的影响

为了探究光信号引起AmRosea1过表达84K杨(Populus alba×P.glandulosa ‘84K’)植株颜色变化的原因,以野生型和AmRosea1过表达84K杨为试验材料,开展LED光、自然光、LED红光、LED蓝光和LED红蓝光处理,测定不同光强和光质下野生型和转基因株系的生理指标变化情况。结果显示：在不同光强下,与LED光处理相比,自然光处理下转基因株系叶片变红,花青素和可溶性糖含量升高,叶绿素含量和POD活性降低。不同光质处理30 d后,与LED红光和蓝光相比,在LED红蓝光诱导下,转基因株系叶片变红,且花青素含量升高,可溶性糖含量和POD活性下降,叶绿素含量略有降低。根据试验结果推测,强光和红蓝光质能激活AmRosea1过表达84K杨的花青素生物合成通路,使转基因株系积累大量的花青素,从而使植株叶片变红。     

毛竹MYB转录因子PeMYB2的克隆与功能分析

MYB类转录因子在调控逆境应答基因的表达起着重要的作用, 是最大的植物转录因子之一。文章通过同源基因克隆方法和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术, 以毛竹幼苗为材料, 获得一个MYB类转录因子, 命名PeMYB2。氨基酸序列分析表明, PeMYB2具有典型的R2R3-MYB特征, N端含有两个串联重复保守结构域, C端含有一个膜蛋白DUF3651; 进化树分析表明, PeMYB2与水稻OsMYB18序列相似性最高, 达到85.98%; 酵母单杂实验表明, PeMYB2具有转录激活功能。将PeMYB2转化拟南芥对其功能进行分析, 获得7株转基因纯合体植株。比较转基因和野生型拟南芥表型发现, PeMYB2的过量表达使转基因拟南芥出现矮化、晚花的现象; 非生物胁迫处理(盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫)结果表明, 转基因拟南芥中PeMYB2的过量表达, 导致转基因植株对盐胁迫和低温胁迫有更高的耐性, 但是对低温胁迫的耐受性没有明显的变化; 进一步通过盐胁迫信号通路相关Marker基因(NXH1、SOS1、RD29A、COR15A)的定量PCR实验验证, 发现PeMYB2对下游这些抗逆基因的表达具有调控作用。上述实验结果表明, 毛竹PeMYB2可参与非生物胁迫调控, 对毛竹盐胁迫和低温胁迫的响应起着重要的作用。     

大豆转录因子GmC2H2基因转化拟南芥效果分析

GmC2H2转录因子基因是本实验室获得的一个编码172个氨基酸携带516bp核苷酸的转录因子,属于经典C2H2型锌指蛋白.通过构建植物表达载体GmC2H2-pCAMBIA1304,借助优化的Floral-dip法转化模式植物拟南芥,经潮霉素Hygromycine( 45-50 mg/L)抗性筛选获得转基因拟南芥植株.GUS组织染色分析表明,GmC2H2基因在生长12d的转基因拟南芥幼苗中,表达部位主要集中在根部.对转基因拟南芥进行了低温(1℃)和脱落酸(200 μmol/L)胁迫处理,测定其生理生化指标,通过real-time qPCR确定目的基因在转基因拟南芥中的表达情况.结果表明,携带GmC2H2目的基因的转基因拟南芥中脯氨酸和可溶性糖水平要高于野生型植株,而丙二醛水平要低于野生型,在抗逆性方面明显优于野生型拟南芥植株;并且胁迫处理下的转基因拟南芥中GmC2H2基因的表达量要高于未胁迫处理的转基因植株,说明GmC2H2基因的表达受低温和ABA的诱导,初步明确了该转录因子基因的功能.     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因表达模式分析

为了解高迁移率族蛋白B族(HMGB)基因在拟南芥中的表达模式及作用方式,该研究克隆了拟南芥中5个编码HMGB的基因:AtHMGB1、AtHMGB2、AtHMGB3、AtHMGB4、AtHMGB5,并运用荧光实时定量PCR方法检测野生型拟南芥中以上5种基因在不同器官中的表达及在外源植物激素(ABA、2,4-D)处理前后的表达差异,选取AtHMGB2、AtHMGB4和AtHMGB5分别转化拟南芥并筛选出超表达株系,随即检测ABA诱导下超表达AtHMGB的转基因拟南芥的表型。研究证实:在野生型拟南芥中AtHMGB2在拟南芥各个器官中的表达量远高于其它家族成员,AtHMGB4和AtHMGB5在花、果荚和根中的表达略高于茎和叶;在ABA处理前后AtHMGB家族成员的表达水平有显著差异,其中AtHMGB2的表达被ABA显著负调控;ABA诱导下超表达AtHMGB2的转基因拟南芥与野生型相比出现萌发及生长迟缓现象,但超表达AtHMGB4与AtHMGB5的转基因拟南芥在ABA诱导下的种子萌发和幼苗生长与野生型相比差异不大。研究发现,AtHMGB家族成员在转录水平上响应ABA的方式各有不同,对理解AtHMGB家族成员的生物学功能提供了新的基础。     

基因芯片技术筛选转SlNAC1基因拟南芥差异表达基因

研究已表明植物特有的一些NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子可提高植物抗逆性,利用基因芯片技术筛选转SlNAC1基因拟南芥与野生型拟南芥间差异表达基因,能够为研究转基因拟南芥非生物胁迫抗性相关基因提供依据。结果显示,在转SlNAC1基因拟南芥43 604个基因中有3 046个差异表达2倍以上的基因。对差异表达5倍以上基因经过GO富集度统计学分析表明,细胞组分相关基因占33.05%;分子功能相关基因占33.95%;生物学过程相关基因占33.00%。对差异表达2倍以上基因进行KEGG信号通路分析,结果表明有2 431个基因涉及到88个不同的信号通路。通过筛选获得转基因拟南芥非生物胁迫抗性相关候选基因,为后续研究NAC转录因子的下游基因及其调控网络的构建提供方向和理论支撑。     

中间锦鸡儿CiMYB15基因正调控拟南芥黄酮代谢

目的:R2R3-MYB类转录因子参与调控植物初生和次生代谢。方法:从中间锦鸡儿(Caragana intermedia)干旱转录组数据库中搜索并克隆了一个R2R3-MYB基因,命名为CiMYB15(GenBank登录号MH678649);将CiMYB15基因编码区转入野生型拟南芥中,利用分光光度法测定了野生型和转基因拟南芥中总黄酮含量,并用qRT-PCR检测了转基因植物中At CHS基因的表达情况。同时采用染色体步移法克隆了CiMYB15基因的启动子序列。结果表明:(1) CiMYB15基因g DNA长度为1 960 bp,包含三个外显子(134、131和521 bp)和两个内含子(281和893 bp);开放阅读框长度为786 bp,编码262个氨基酸。(2)克隆得到1 580 bp的启动子序列,序列中主要包含损伤诱导元件G-box和P-box、盐诱导作用元件GT1-motif、参与干旱诱导的反应元件MBS,以及真菌侵害应答元件BOX-W1、植物-病原菌互作元件EIER;此外,还包含调节黄酮合成基因的MYB转录因子的结合位点。(3) CiMYB15基因的表达受到紫外胁迫的诱导。(4) CiMYB15基因过表达株系的总黄酮含量高于野生型。(5)过表达植物中At CHS基因的表达量亦高于野生型。以上结果说明,CiMYB15基因正调控拟南芥黄酮代谢。     

陆地棉MYB类转录因子基因GhTT2克隆及功能初步分析

原花青素作为植物重要的次生代谢产物,是植物应对生物和非生物胁迫的一种重要防御手段,也是影响植物发育和品质的重要因素。原花青素作为花青素生物合成的一条末端通路在模式植物中已有研究,但是具体代谢和调控机制尚不明确;原花青素作为棕色棉纤维呈色的主要物质,其棉纤维呈色的生化与分子机制仍未完全阐明。本研究从陆地棉(Gossypium hirsutum)中克隆了一个MYB类转录因子基因GhTT2 (transparent testa 2),并对其基因结构、表达模式、亚细胞定位及功能进行了分析。结果表明：GhTT2转录因子具有典型的MYB结构域,在纤维中优势表达,其转录水平随花青素含量增加而降低;该基因可被原核诱导表达;与GFP融合的重组蛋白定位在细胞核;酵母转化结果表明GhTT2具有转录激活功能;在棉花中沉默GhTT2基因的表达,导致原花青素含量显著降低,表明其可能参与调控陆地棉原花青素的生物合成。本研究结果为深入阐明MYB类转录因子参与调控植物原花青素生物合成途径的分子机制提供参考。     

热激启动子18.2在金鱼草中启动下游基因表达最适温度条件的筛选

为了研究温度对植物根系中基因表达的影响,构建了由拟南芥小热激蛋白18.2基因的启动子和金鱼草中调控花青素生物合成的基因(Rosea1)组成的植物表达载体pBIPhsp::ROS,利用遗传转化法得到毛状根,以根系颜色变化为指标,探讨了温度变化对植物根系基因表达的影响。结果表明:37、40和42℃热激处理4 h后,在毛状根中均能观察到一定程度的花青素积累;在42℃条件下处理8 h时,转基因毛状根颜色变化最深;RT-PCR分析表明,Rosea1基因的表达水平与毛状根着色呈正相关。该体系可作为温度对植物根系影响研究的一种指示标记和手段。     

转CiCHS基因拟南芥的黄酮代谢及抗氧化能力分析

该研究克隆了中间锦鸡儿的查尔酮合成酶基因(CiCHS)并转入野生型拟南芥和tt4突变体,用qRT-PCR检测了转基因拟南芥中内源AtCHS基因的表达量,用分光光度法分析了转基因拟南芥的总黄酮、丙二醛含量及DPPH自由基清除能力,用HPLC法检测了转基因拟南芥的柚皮苷含量。结果显示:(1)转基因拟南芥中,内源AtCHS基因的表达量约为野生型的十分之一,总黄酮含量明显高于野生型;HPLC测得转基因株系中柚皮苷含量高于野生型;紫外照射处理前后转基因拟南芥中丙二醛积累量明显少于野生型。(2)转基因株系提取物对DPPH自由基清除能力显著高于野生型。(3)CiCHS基因互补拟南芥tt4突变体,转基因株系的种皮呈现浅棕色。研究表明,中间锦鸡儿CiCHS基因异源表达后生成了柚皮苷,使转基因植物的抗氧化性增强,部分恢复了tt4突变体的种皮颜色。     

谷子MYB类转录因子SiMYB42提高转基因拟南芥低氮胁迫耐性

Myeloblastosis (MYB)类转录因子是高等植物中最大的转录因子家族之一,在植物发育及防御反应过程中发挥重要作用,还参与植物对干旱等非生物胁迫的响应。谷子(Setaria italica L.)起源于中国,具有抗旱、耐瘠薄的特性,是研究单子叶作物非生物胁迫抗性的理想材料。本研究对耐低氮胁迫谷子品种郑204经低氮处理后进行转录组分析,鉴定出一个在低氮胁迫条件下明显上调的MYB类转录因子SiMYB42。系统发育树结果表明,SiMYB42属于R2R3-MYB亚族,具有2个MYB保守域;表达模式分析显示,SiMYB42在低氮、高盐、干旱和ABA胁迫条件下表达量显著上调;亚细胞定位、quantitative real-time PCR及转录激活活性分析结果表明,SiMYB42蛋白定位于植物的细胞核和细胞膜中,主要在谷子的叶部或根部表达,具有转录激活活性;基因功能分析结果表明,在正常条件下,转SiMYB42基因拟南芥与野生型Columbia-0拟南芥(WT)无明显差异,但在低氮条件下,转SiMYB42基因拟南芥的主根长、根系表面积及鲜重均显著高于WT,结果证明SiMYB42基因可以提高转基因植物对低氮胁迫的耐性;下游基因表达分析结果显示,在转SiMYB42基因拟南芥中,参与植物氮素转运的硝酸盐转运基因NRT2.1、NRT2.4和NRT2.5的表达水平均高于WT,启动子分析结果显示NRT2.1、NRT2.4和NRT2.5基因启动子序列中均具有MYB结合位点。以上结果证明,SiMYB42可以通过调控下游硝酸盐转运体基因的表达提高植物在低氮条件下的耐性。本研究揭示了SiMYB42基因在低氮胁迫反应途径中的作用,为进一步了解谷子低氮胁迫响应的调控网络奠定了基础。     

过量表达大叶补血草LgNHX1基因对拟南芥耐盐性的影响

利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌GV3101将LgNHX1(全长1 656 bp)基因在拟南芥中过量表达.在含30 mg/L潮霉素的培养基上筛选获得LgNHX1的纯合转化子,并对其进行了分子鉴定和耐盐性分析.结果显示,经PCR和RT-PCR鉴定,野生型植株(对照)没有出现扩增条带,而转基因株系有相应的扩增条带,表明LgNHX1的确已经整合到拟南芥的基因组中,并已正常转录.在不同盐浓度处理下,转基因株系生长情况好于野生型对照;转基因植株地上部分和根的干重、鲜重相对高于野生型对照,但差异没有达到显著水平;当盐浓度达到150-200 mmol/L时,两个特基因株系的Na+含量显著高于野生型,K+含量极显著高于野生型.以上结果表明,过量表达LgNHX1基因可能增强了拟南芥将Na+区隔化至液泡的能力,提高了转基因拟南芥的耐盐能力.     

外源蔗糖影响AtKEA1和AtKEA2调节拟南芥幼苗根的生长

为探究拟南芥(Arabidopsis thaliana)K+/H+反向转运体KEA1和KEA2在植物生长发育过程中的功能作用,以拟南芥野生型和kea1kea2功能缺失突变体为研究材料,通过表型分析,碘化丙啶染色观察根的结构,高效液相色谱法测定内源糖含量,转录组测序及实时荧光定量PCR比较分析相关基因表达量的变化,组织化学染色检测叶片超氧阴离子的分布等研究发现：在没有蔗糖的培养基中,kea1kea2双突变体的根长显著短于野生型Col-0;进一步观察发现,与野生型相比,kea1kea2双突变体的根尖分生组织区较短,内源蔗糖含量下降,并且kea1kea2双突变体的叶片分布较多的O₂^·-。当外源添加30 g·L^-1蔗糖后,野生型与kea1kea2双突变体的根长无显著差异。转录组测序分析显示,许多参与蔗糖信号和根生长发育的关键基因在kea1kea2双突变体中的表达受到抑制。综上所述,外源蔗糖影响AtKEA1和AtKEA2参与调节的拟南芥幼苗根的生长。     

拟南芥CKI1基因上游转录调控因子筛选及鉴定

拟南芥CKI1(cytokininindependent 1)是双组分信号系统中一个组氨酸激酶蛋白,通过作用于下游组氨酸磷酸转移蛋白激活双组分信号通路,在调控胚囊中央细胞命运分化和发育过程中具有重要作用。然而目前对于CKI1基因上游转录调控因子还知之甚少。本研究分析了不同长度的CKI1启动子在拟南芥胚囊中的活性,并利用酵母单杂交技术对CKI1上游转录调控因子进行了筛选和鉴定。结果表明,位于内含子区域中的F5/R2片段表现出与CKI1启动子全长相一致的表达活性。进一步选取3个串联重复的F5/R2片段用于构建诱饵表达载体,同时,选取拟南芥雌蕊构建cDNA文库,通过酵母单杂交筛选获得226个阳性克隆。去除低质量及冗余重复的序列后共获得66条可读序列,其中8条序列对应的基因编码具有DNA结合功能的蛋白。研究结果为进一步揭示CKI1基因的转录调控机制提供了重要参考信息。     

一个种子特异的大豆AP2类转录因子参与调控种子萌发

植物种子的发育和萌发受严格的时空调控,其中转录因子起着重要的作用．本研究发现了一条在发育过程中的大豆种子里特异表达的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）．通过末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA end,RACE）得到该基因的全长序列并命名为GmSGR．序列分析表明该基因属于AP2／ERF类转录因子家族,其AP2结构域与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的AP2／ERF基因家族DREB亚家族中A-3组的AtABI4的AP2结构域同源性极高．在酵母系统中,未检测到GmSGR具有转录激活活性．将该基因在拟南芥中过量表达,在高浓度的脱落酸（abscisicacid,ABA）及葡萄糖的条件下,转基因植物种子的萌发率均高于对照组;而在高浓度的NaCl条件下,转基因植物种子的萌发率低于对照组．在转基因植物的幼苗中,AtEm6和AtRD29B的表达较野生型幼苗高．这些结果表明GmSGR可能通过调控AtEm6和AtRD29B的表达,从而导致转基因种子对ABA敏感度降低,对盐胁迫更敏感．