独行菜LaAP2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

AP2/ERF是广泛存在于植物中一类重要的转录因子,调控一些参与非生物胁迫相关基因的表达,帮助植物提高逆境胁迫能力。为了深入探讨LaAP2在独行菜耐受低温萌发及幼苗耐受低温生长中的功能,该研究基于前期对独行菜(Lepidium apetalum)转录组数据库分析,克隆获得一个显著上调表达的AP2/ERF家族序列LaAP2。该基因cDNA全长为1 005 bp,编码氨基酸序列包含一个AP2和一个B3结构域,属于AP2/ERF转录因子RAV亚家族。推定的LaAP2蛋白分子量为37.744 67 kD,等电点为9.49。该蛋白氨基酸序列同亚麻荠、拟南芥、油菜等物种显示出较高同源性,系统进化分析结果表明与拟南芥亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明,LaAP2基因所编码的蛋白不具备信号肽区段,无跨膜区,不属于分泌蛋白,可能为亲水性蛋白;定位于细胞质的可能性为56.5%,定位于细胞核的可能性为21.7%;其主要二级结构元件为无规则卷曲、延伸链、α-螺旋。Real-time PCR分析独行菜幼苗中LaAP2在低温4℃处理下的表达,显示LaAP2表达受低温胁迫呈先下降后升高趋势。这表明LaAP2在独行菜幼苗抵抗低温胁迫中起调控作用。     

植物AP2/ERF转录因子家族的研究进展

作为植物最大转录因子家族之一,AP2/ERF转录因子广泛存在于植物中,并因其在基因育种等方面具有重要作用而倍受关注。AP2/ERF转录因子家族成员至少含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域,根据结构域的数量和识别序列的不同可以将其分为AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist 5个亚家族,且在拟南芥、水稻、玉米和番茄等植物中,AP2/ERF转录因子及其各个亚家族成员的数量各不相同。研究发现,AP2/ERF转录因子可通过响应乙烯、细胞分裂素和生长素的调节从而直接或间接参与种子发育过程、花和果实等器官的形态建成等植物发育的多个进程;除了初生代谢,AP2/ERF转录因子还在植物次生代谢尤其是在调控药用植物主要药用活性成分(如青蒿素、紫杉醇和木质素)合成方面效果显著。同时,有报道称拟南芥AP2/ERF基因具有正向调节抗灰霉病的功能,一些AP2/ERF基因也被报道在植物应对高盐、干旱、缺氧、低温等非生物胁迫方面具重要功能;另外,AP2/ERF类转录因子还参与了乙烯等介导的非生物信号传导。介绍AP2/ERF转录因子的结构分类特征、在不同植物中的数量分布,并阐述其在植物发育、次生代谢、生物与非生物胁迫和信号传导等方面的研究进展,以期为培育出兼具高产、抗病的实用型转基因作物提供理论依据。     

AP2/EREBP转录因子在植物发育和胁迫应答中的作用

AP2／EREBP（APETALA2/ethylene-responsive element binding proteins）是一个起源古老的转录因子超家族,它含有1个或2个由约60—70个氨基酸残基组成的非常保守的DNA结合域（DNA-binding domain）,即AP2／ERF结构域。根据AP2／ERF结构域的数目,AP2／EREBP转录因子可以分为2个亚族：EREBP亚族（具有1个AP2／ERF结构域）和AP2亚族（具有2个AP2／ERF结构域）。AP2亚族转录因子有调控花、胚珠和种子发育的功能,而EREBP亚族转录因子（包括DREB类和ERF类）的主要功能是调节植物对激素（乙烯和ABA等）、病原和胁迫（低温、干旱及高盐）等的应答反应。本文讨论了AP2／EREBP转录因子在植物发育和胁迫应答中的研究进展。     

苹果DREB转录因子家族全基因组鉴定与分析

DREB转录因子属于AP2/ERF转录因子家族,能够与DRE/CRT顺式作用元件特异性结合,调控与逆境应答基因的表达,因而在植物应对低温、干旱、高盐等逆境胁迫中发挥重要作用。该研究利用苹果全基因组数据,通过生物信息学手段鉴定苹果DREB转录因子家族成员,并分析DREB转录因子家族保守域特点与功能及表达情况。结果表明:从苹果全基因组中共鉴定出60个DREB转录因子家族成员,与拟南芥和水稻相比基本一致,通过引入拟南芥DREB基因进行系统发生分析,进一步可以将其细分为6个亚组;结构域和保守元件分析表明,DREB基因家族含有一个AP2保守结构域;染色体定位表明,苹果DREB基因分布于11条染色体上,部分基因存在串联复制现象;基因结构分析显示,该亚家族基因不含内含子。利用同源拟南芥RNA-Seq数据分析结果表明,DREB转录因子家族对低温、ABA调节等非生物胁迫具有调控作用,同时在DREB亚家族中每个亚组响应不同的非生物胁迫;通过分析DREB基因在不同组织中的表达情况,结果显示DREB基因在植物根部中的表达量最强,其次是叶。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因表达模式分析

为了解高迁移率族蛋白B族(HMGB)基因在拟南芥中的表达模式及作用方式,该研究克隆了拟南芥中5个编码HMGB的基因:AtHMGB1、AtHMGB2、AtHMGB3、AtHMGB4、AtHMGB5,并运用荧光实时定量PCR方法检测野生型拟南芥中以上5种基因在不同器官中的表达及在外源植物激素(ABA、2,4-D)处理前后的表达差异,选取AtHMGB2、AtHMGB4和AtHMGB5分别转化拟南芥并筛选出超表达株系,随即检测ABA诱导下超表达AtHMGB的转基因拟南芥的表型。研究证实:在野生型拟南芥中AtHMGB2在拟南芥各个器官中的表达量远高于其它家族成员,AtHMGB4和AtHMGB5在花、果荚和根中的表达略高于茎和叶;在ABA处理前后AtHMGB家族成员的表达水平有显著差异,其中AtHMGB2的表达被ABA显著负调控;ABA诱导下超表达AtHMGB2的转基因拟南芥与野生型相比出现萌发及生长迟缓现象,但超表达AtHMGB4与AtHMGB5的转基因拟南芥在ABA诱导下的种子萌发和幼苗生长与野生型相比差异不大。研究发现,AtHMGB家族成员在转录水平上响应ABA的方式各有不同,对理解AtHMGB家族成员的生物学功能提供了新的基础。     

陆地棉GhPYR1基因的克隆和功能分析

植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)在植物应对干旱、盐碱等逆境胁迫以及植物种子萌发、根伸长、芽休眠等阶段发挥重要作用。PYR/PYL/RCAR蛋白家族是ABA受体,与ABA结合后能够启动ABA信号传导通路,诱导ABA应答基因的表达。利用电子克隆和RT-PCR技术从陆地棉中克隆了Gh PYR1基因,其编码的Gh PYR1蛋白与拟南芥中At PYR1蛋白相似度为73%。将Gh PYR1蛋白序列与拟南芥14个PYR/PYL/RCAR家族成员蛋白序列进行比对并构建进化树,发现它与拟南芥PYR/PYL/RCAR蛋白亚家族III亲缘关系最近。过表达Gh PYR1基因的T3代拟南芥在外源ABA处理下,其种子萌发和初期根生长均滞后于野生型,表现出对ABA更加敏感;高盐和干旱胁迫对转基因种子的萌发抑制更强烈,但苗期胁迫处理下转基因拟南芥的长势却明显优于野生型;同时在外源ABA诱导条件下ABA应答基因RD29A、RAB18的表达量较野生型有明显提高。以上结果说明Gh PYR1基因编码的蛋白是ABA的受体,过表达该基因能够提高植物对ABA的敏感性和增强应对逆境胁迫的能力。     

甘蓝型油菜中一类AP2/ERF转录因子的克隆和生物信息学分析

AP2/ERF转录因子家族是植物中广泛存在的一类转录因子,AP2/ERF这类转录因子主要参与植物的细胞周期、生长发育以及生物和非生物胁迫相关基因的表达调控。由于拟南芥和油菜同属于芸薹属,具有相似的基因信息,利用油菜UniGene数据库,以拟南芥ERF转录因子保守序列为探针,通过电子克隆从一个UniGene Cluster中分离得到三个同类的AP2/ERF转录因子,从cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性分析、序列比对、进化树、功能域、二级结构、三级结构、无序化特性进行了预测和较为全面的分析。结果显示油菜来源的BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3属于AP2/ERF转录因子的B-2亚族,是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与AtERF1相似。蛋白质无序化分析发现,油菜BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3无序化程度小于拟南芥AtERF1。设计引物通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型双低油菜沪油15幼苗的DNA和cDNA中扩增了上述基因,初步分析BnaERF2没有内含子,BnaERF1和BnaERF3有内含子。另外,通过EST丰度分析显示,该类转录因子的表达最高峰在种子中,其次为花,在芽、茎和分生组织中没有检测出表达的存在。     

盐穗木miRNA417的克隆及对种子萌发和幼苗成活率的影响

MicroRNA (miRNA)是植物重要的基因表达调控因子,miR417的表达受盐胁迫的调节,高盐胁迫时,拟南芥miR417的表达能够抑制种子的萌发和幼苗成活。本研究通过分析miRbase数据库中已知植物miRNA417的序列,利用PCR技术成功克隆获得了盐生植物盐穗木的miR417（HcmiR417）的前体序列,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301上,通过花絮浸染法对拟南芥进行遗传转化。结果表明,在150 mmol·L^-1 NaCl的胁迫下,分别过表达HcmiR417和过表达拟南芥miRNA417（AtmiR417）的转基因拟南芥种子的萌发率和幼苗存活率均较野生型低,但两种转基因拟南芥株系之间没有差异。初步验证了盐生植物HcmiR417在种子萌发和幼苗成活率方面也具有负调控作用,盐生植物盐穗木和拟南芥植物miRNA在功能没有显示出差异。     

异子蓬SabHLH169基因的克隆及抗旱功能分析

碱性螺旋-环-螺旋（basic belix-loop-helix,bHLH）转录因子是真核生物中最大的转录因子家族之一，其成员广泛参与植物生长、发育和胁迫响应。前期在异子蓬（Suaeda aralocaspica）光合作用关键酶PEPC-1的研究中筛选到一个可能与SaPEPC-1启动子相互作用的bHLH转录因子SabHLH169，探明该基因功能将为后期异子蓬bHLH基因的深入研究奠定基础。通过克隆获得该基因，采用生物信息学、实时荧光定量PCR等方法，初步探究SabHLH169基因的耐旱功能。结果显示，SabHLH169包含2 100 bp核苷酸，编码699个氨基酸，其蛋白质C末端具有典型的bHLH结构域，原核表达和Western blot分析表明，SabHLH169重组蛋白能够正确表达，其分子量大小与预测结果一致。过表达SabHLH169的拟南芥转基因株系在萌发期具有更高的耐旱性；干旱胁迫下，转基因拟南芥中3个干旱胁迫相关基因AtRD22、AtRD29A和AtDREB2A以及3个光合作用关键酶基因AtLhcb2、AtRubicso和AtPEPC的表达水平显著升高，且AtPEPC酶活性被...     

ERF转录因子在植物对生物和非生物胁迫反应中的作用

ERF（ethylene responsive factor）转录因子是植物AP2/ERF转录因子超家族的一个亚家族,其特征是蛋白序列中含有一个高度保守的58或59个氨基酸组成的ERF结构域,广泛参与植物生长发育及各种逆境胁迫反应的调控。文章简要介绍ERF转录因子在植物抗生物和非生物胁迫反应中的作用及其可能机制,并讨论了今后的研究重点。     

AP2/EREBP 转录因子在植物发育和胁迫应答中的作用

AP2/EREBP (APETALA2/ethylene-res ponsive element binding proteins) 是一个起源古老的转录因子超家族, 它含有1个或2个由约60-70个氨基酸残基组成的非常保守的DNA结合域 (DNA-binding domain), 即AP2/ERF结构域。根据AP2/ERF结构域的数目, AP2/EREBP转录因子可以分为2个亚族: EREBP亚族(具有1个AP2/ERF结构域)和AP2亚族(具有2个AP2/ERF结构域)。AP2亚族转录因子有调控花、胚珠和种子发育的功能, 而EREBP亚族转录因子(包括DREB类和ERF类) 的主要功能是调节植物对激素(乙烯和ABA等)、病原和胁迫(低温、干旱及高盐)等的应答反应。本文讨论了AP2/EREBP转录因子在植物发育和胁迫应答中的研究进展。     

小麦E3泛素连接酶基因TaAIRP2-1B克隆及功能分析

干旱等非生物胁迫严重影响农作物生产。本研究克隆了小麦(Triticum aestivum L.)TaAIRP2-1B基因,探讨其对非生物胁迫的响应机制,为促进小麦抗旱性的遗传改良提供基因资源。组织特异性表达模式分析显示,TaAIRP2-1B基因在小麦抽穗期的各个组织中均有表达,在茎组织中的表达水平较高,而根系中的表达水平较低。非生物胁迫表达模式分析显示,Ta AIRP2-1B受ABA、PEG及冷胁迫诱导表达。过表达TaAIRP2-1B拟南芥在0.4μmol/L的ABA处理条件下,种子发芽率显著低于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥种子萌发期对ABA的敏感性。ABA处理抑制转基因和野生型拟南芥幼苗的根系生长,但转基因拟南芥受抑制程度显著高于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥幼苗对ABA的敏感性。转基因结果表明超表达TaAIRP2-1B增强了拟南芥的抗旱性,并且转基因株系的保水率显著高于野生型。总之,本研究发现小麦基因Ta AIRP2-1B参与了植物对非生物胁迫的应答,可能是通过ABA途径正向调控植物的抗旱性。     

花烟草NaERF1基因的克隆及在非生物胁迫下的表达模式分析

AP2/ERF类转录因子,是植物所特有的最大的一类转录因子家族,在植物的生长发育过程中,扮演着重要的角色。探究花烟草ERF转录因子的生理功能,为花烟草抵御逆境的分子机制研究提供借鉴。采用同源克隆的方法进行基因克隆。通过对花烟草进行非生物胁迫,运用qPCR的方法进行基因表达模式分析。从花烟草(Nicotiana alata)中克隆了一个属于ERF家族的基因NaERF1。该基因的开放阅读框全长为819 bp,编码了272个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白分子量为30.7 kD,等电点为6.07;具有AP2/ERF类转录因子家族典型的保守结构域;该基因主要定位于细胞质内,并含有多个磷酸化位点。同源性分析的结果显示,NaERF1基因与茄科植物的ERF同源性较高,并且与普通烟草的ERF亲缘关系最近。NaERF1基因的表达具有组织表达特异性,花中表达量最高,茎中次之,根和叶中表达量较低。同时,在高盐、干旱、低温、ABA、低钾及H2O2等非生物胁迫下,NaERF1的表达呈现5种模式。其中,对低钾及ABA胁迫的响应强烈。NaERF1基因属于AP2/ERF类转录因子,可能广泛参与了花烟草包括非生物胁迫响应在内的众多生理过程。     

独行菜种子bHLH类转录因子基因家族及幼苗laICE1表达对冷胁迫的响应

该研究在转录组数据基础上,以独行菜(Lepidium apetalum Willd.)种子耐受和不能耐受低温萌发的2组样本为材料,对其bHLH转录因子家族成员进行分析,并对该家族成员表达差异极显著的laICE1基因进行克隆、序列分析、结构预测,以探讨独行菜幼苗中laICE1基因表达对低温胁迫的响应特征。结果表明:(1)萌发中的独行菜种子,至少有83个bHLH转录因子序列表达,相对于低温萌发停滞组,在低温萌发耐受组的独行菜种子中,有10个下调、13个上调、60个表达差异不显著。其中表达量极显著下调的序列c20009_g1具有1 503bp开放阅读框,GO注释到ICE1基因,该基因命名为laICE1。(2)laICE1基因编码500aa,蛋白分子量为54 635.19kD,理论等电点为5.45,分子式为C2364H3742N688O758S22;该蛋白具有保守结构域bHLH。(3)定量分析表明,laICE1基因在非低温胁迫的独行菜种子中的表达量显著低于一直处于低温胁迫中不能进行萌发的独行菜种子,这与转录组数据库中该序列表达情况一致;而laICE1基因在独行菜幼苗期经低温处理后,其表达量显著上调,表明laICE1基因可能在独行菜幼苗耐受低温生长中具有一定的作用。     

中间锦鸡儿WRKY75基因对拟南芥耐受盐和ABA能力的影响

该研究从旱生灌木中间锦鸡儿中克隆得到1个CiWRKY75基因。序列分析显示,CiWRKY75开放阅读框长570bp,编码189个氨基酸,含有1个WRKYGQK基序和1个C2H2型锌指结构,属于第二类WRKY转录因子。亚细胞定位显示,CiWRKY75定位于细胞核。实时荧光定量PCR检测表明,CiWRKY75基因的表达受盐胁迫和ABA诱导。在拟南芥中过量表达CiWRKY75后,与野生型拟南芥相比,转基因株系种子的萌发率在盐胁迫下降低,并且对盐胁迫的耐受能力明显减弱;ABA处理下,2个转基因株系的种子萌发率(10.3%、9.6%)较野生型(25.9%)明显降低。研究表明,CiWRKY75是中间锦鸡儿对盐和ABA响应的重要调控因子。     

葡萄(Vitis vinifera)AP2/ERF转录因子基因家族序列分析

AP2/ERF基因家族是植物特有的转录因子家族之一,参与植物细胞生长发育以及逆境胁迫等多个生理过程的调节。本文对欧洲葡萄基因组中存在的124个AP2/ERF类的转录因子基因进行分析,提供了基因结构、染色体定位、内含子数目以及编码的蛋白质大小等信息;利用NCBI的EST数据库,在葡萄13个组织、器官中分析了AP2/ERF基因的电子表达模式,结果表明AP2/ERF基因的表达具有明显的组织特异性;采用MEME及Interpro Scan等程序首先对所有ERF基因的保守结构域进行分析以及利用Mega 5等软件对所有AP2/ERF基因家族进行系统进化分析。     

拟南芥甲基结合蛋白基因AtMBP11启动子在种子形成和萌发中的功能鉴定

为研究拟南芥甲基结合蛋白基因AtMBP11在种子形成和萌发过程中的调控模式,克隆拟南芥AtMBP11启动子,将其替换植物表达载体pBI121的35S启动子序列,转入拟南芥基因组中.转基因拟南芥后代卡那霉素抗性发生分离,选取具有3∶1分离比的后代自交,产生纯合的具有单拷贝插入的后代.转基因后代GUS染色结果表明,新克隆的MBP启动子控制基因在种子、花药和花粉中高效表达.通过对AtMBP11核心启动子缺失分析表明,G-box元件是主要功能元件.     

水稻含有B-box锌指结构域的OsBBX25蛋白参与植物对非生物胁迫的响应

锌指蛋白在调控植物生长发育和应对逆境过程中发挥着重要作用.为进一步研究锌指类蛋白参与植物非生物胁迫响应的分子机制,对水稻(Oryza sativa)中一个编码含有B-box锌指结构域蛋白的OsBBX25基因进行了功能分析.OsBBX25受盐、干旱和ABA诱导表达.异源表达OsBBX25的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)与野生型相比对盐和干旱的耐受性增强,且盐胁迫条件下转基因植物中KIN1、RD29A和COR15的表达上调,干旱胁迫下KIN1、RD29A和RD22的表达上调.外源施加ABA时,转基因植物的萌发率与野生型之间没有明显差异.OsBBX25可能作为转录调控的辅助因子调节胁迫应答相关基因的表达,进而参与植物对非生物胁迫的响应.     

拟南芥高迁移率族蛋白B（AtHMGB）族基因启动子的转录激活功能分析

为了解高迁移率族蛋白B族（high mobility group protein B,HMGB）基因调控植物响应低温、高盐和干旱等外源胁迫的表达调控方式, 本文克隆了拟南芥AtHMGB前5个家族成员的启动子区域（PAtHMGB1,PAtHMGB2,PAtHMGB3,PAtHMGB4和PAtHMGB5）.运用基因重组技术将其分别替换表达载体上35S启动子区域获得重组表达载体,利用农杆菌介导法侵染烟草获得稳定表达的转基因烟草. 运用实时定量PCR检测上述5种启动子的转基因烟草,观察在外源胁迫（低温、高盐和干旱）处理前后gusA基因的表达差异,同时检测转基因烟草种子在不同外源胁迫条件下的萌发状况. 检测结果证实,在低温胁迫下,PAtHMGB2,PAtHMGB3和PAtHMGB4正调控gusA基因的表达,而在干旱或盐胁迫下,gusA基因的表达被PAtHMGB2和PAtHMGB3负调控. 种子萌发结果表明,在干旱胁迫下,PAtHMGB2调控下的转基因烟草比野生型烟草萌发及生长迟缓|在低温胁迫下,PAtHMGB2调控的转基因烟草长势明显强于野生型. 本研究克隆了拟南芥AtHMGB家族前5个成员启动子,分析其生物学功能发现,PAtHMGB2在响应低温和干旱胁迫方面效果尤为显著.