猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型的建立

目的　建立猪内源性反转录病毒感染HEK2 93细胞的模型 ,验证PERV在体外对人源细胞的感染性 ,并进一步研究PERV的生物学特性。方法　将G4 18抗性的HEK2 93细胞与猪源PK 15细胞共培养 ,6周后 ,用含有6 0 0 μg mlG4 18的选择性培养基对共培养细胞进行加压筛选 ,用以除去共培养体系中的PK 15细胞 ;然后应用PCR及RT PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。结果　经 6周共培养及 3周加压筛选后 ,细胞的形态、生长速度及折光性均未见明显变化 ;PCR及RT PCR鉴定表明 ,筛选后的共培养体系中已没有PK 15细胞的存在 ;PERV特异性检测方法检测显示 ,该细胞模型的DNA中已有PERV的整合且有PERV特异性mRNA的表达。结论　本实验成功建立了PERV感染HEK2 93细胞的模型 ,证实了PERV在体外对人源细胞具有感染性 ;为PERV生物学特性的研究奠定了基础     

稳定表达hHCN2基因 HEK293细胞系的建立

目的：培育稳定表达hHCN2基因的细胞系,建立一种表达研究心肌离子通道的有效模型。方法：通过脂质体转染的方法,将重组pcDNA3-hHCN2真核表达载体导入人胚肾细胞（HEK293细胞）,以G418压力筛选转染细胞,并对其进行全细胞膜片钳记录。结果：经600μg／ml压力筛选后,获得抗性细胞克隆,并用全细胞膜片钳技术记录到克隆hHCN2通道编码电流。结论：本实验采用脂质体转染法成功地培育出G418抗性HEK293细胞。为进一步研究克隆离子通道结构和功能的关系奠定基础。     

G418和潮霉素B双重抗性小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

通过脂质体转染的方法,先后将含有neo基因的质粒pWL／neo和含有潮霉素基因的质粒导入NIH3T3细胞中,利用G418和潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,经500μg／ml的G418和300μg／ml潮霉素B压力筛选后,获得了具有G418和潮霉素B双重抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,用PCR法特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段。生长在双抗NIH3T3细胞饲养层上ES细胞基本保持正常ES细胞特征,成功地培育了G418和潮霉素双重抗性的NIH3T3细胞,为进行pTet-on和pTRE-H-Insulin目的基因电转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。     

潮霉素抗性3T3细胞的建立和鉴定

目的　建立具有潮霉素 (hygromycin)抗性的 3T3细胞系 ,用于转染目的基因 (pTRE Ins human)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因的质粒pHyg导入 3T3细胞中 ,利用潮霉素的药物选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行PCR鉴定。结果　经 5 0 0 μg ml的潮霉素压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性 3T3细胞的形态和生长速度与正常 3T3细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了潮霉素抗性的 3T3细胞 ,为进行目的基因 (pTRE Ins human)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础。     

具潮霉素B抗性的NIH3T3细胞饲养层的制备

[目的]建立具有潮霉素B(hygromycinB)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE2-human-Ins)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。[方法]通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因(hyg)的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和southernblot鉴定。[结果]经300ug/ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞。[结论]本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。     

用于活体影像技术稳定表达荧光素酶的肺癌细胞系的建立

目的:建立稳定表达萤火虫荧光素酶的人肺癌细胞系并进行体外验证.方法:亚克隆萤火虫荧光素酶基因到真核表达载体pRc/CMV2上,构建重组质粒pRc/CMV2.1uc+,转染到肺癌细胞株spc-a-1,经过G418筛选获得单细胞抗性克隆.抗性克隆连续传代,并通过荧光素酶活性检测筛选出高水平表达荧光素酶的稳定细胞克隆,在体外检测细胞的生物发光能力与细胞数量的相关性.结果:构建的pRc/CMV2-1uc+真核表达质粒转染spe-a-1细胞后,经G418筛选出多个抗性克隆;传代至40代时确定有3株细胞的荧光素酶活性最高;活体影像系统体外检测证实阳性细胞株发光强度与数量呈正相关.结论:结果表明成功构建了稳定表达萤火虫荧光素酶的spc-a-1细胞系.     

稳定整合pTet-on载体小鼠胚胎干细胞株的建立

目的建立稳定整合Tet-on基因的ES-D3细胞系,用于人胰岛素基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中诱导表达调控的研究。方法通过电穿孔转染的方法,将pTet-on质粒导入ES-D3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染的ES-D3细胞进行压力筛选,用PCR和Southern blot方法进行DNA整合鉴定,并用瞬时转染荧光素酶报告基因(pTRE-Luc)对筛选的Tet-on阳性克隆株的功能进行鉴定。结果经400μg/mL的G418压力筛选后,获得了11个细胞克隆株,特异性核苷酸引物检测细胞基因组DNA,有9个ES-D3细胞株可以扩增出相应的核苷酸片段,部分Tet-on阳性ES-D3株Southern blot鉴定结果表明Tet-on基因片段已整合入ES-D3细胞基因组DNA,荧光素酶报告基因功能鉴定获得1株诱导表达倍率为21.31的ES-D3细胞株,且Tet-on基因阳性ES-D3细胞的形态和生长速度与正常ES-D3细胞没有差异。结论通过电穿孔转染的方法成功地获得1株诱导表达倍率为21.31的高表达ES-D3细胞株,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中转染和诱导表达打下了基础。     

Pmscv-Ubc9逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的：构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法：聚合酶链反应（PCR）扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果：限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论：携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

Pmscv-Ubc9 逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

高表达人cyclin G2基因的SGC-7901细胞克隆筛选和鉴定

应用脂质体基因转染技术建立稳定表达cyclin G2基因的胃癌克隆细胞,为深入研究cyclin G2在胃癌细胞周期调控的作用和机制提供理想的生物学模型.构建以新霉素基因作为筛选标志基因的包含人cyclin G2基因真核重组表达载体pIRES-G2,大量扩增纯化后经限制性内切酶BamH I/BstXI双酶切鉴定;利用阳离子脂质体介导的基因转染法将其和对照空载体pIRESneo转染人胃癌细胞SGC-7901,经G418选择性培养基筛选后有限稀释法连续克隆化,免疫细胞化学染色检测cyclin G2蛋白表达情况.酶切结果表明cyclin G2cDNA已成功插入pIRESneo的多克隆位点内;经G418筛选后在转染pIRES-G2和转染pIRESneo组均见多个细胞克隆出现,细胞化学染色证实pIRES-G2转染组cyclin G2蛋白的表达水平明显高于pIRESneo转染组;经过多次有限稀释获得稳定高表达cyclin G2的细胞克隆.应用脂质体转基因技术成功建立高表达cyclin G2基因的人胃癌细胞克隆.     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

Electroporation: application to human lymphoid cell lines for stable introduction of a transactivator gene of human T-cell leukemia virus type I.

Conditions were developed for stable introduction of foreign DNA into human lymphoid cell lines by electroporation. To introduce stably the p40 gene of human T-cell leukemia virus type I (HTLV-I) into the human lymphoid cell line Jurkat, the p40 expressing plasmid, pMAXRHneo-1, which carries the neo resistant gene, was transfected into Jurkat cells at a voltage of 2500 V and capacitance of 21.7 microF, and stable transformants were screened for neo (G418) resistance. The frequency of transformants was more than one per 2 x 10(5) cells used initially. Clones that were resistant to G418 were shown to have the p40 gene integrated into the host genome and to express mRNA and protein from the introduced plasmid. Expression of p40 in the transformed Jurkat cells was also confirmed by testing the trans-activating effect of HTLV-I enhancer by p40. High frequencies of stable transformations of 10(-4) to 10(-6) were also reproducibly obtained by electroporation of the human T cell lines HSB-2 and TALL-1, a human B cell line Raji, a human monocytic cell line U937, and a human erythroleukemia cell line K562. These results demonstrate that electroporation is a very efficient method for introducing foreign DNA into human lymphoid cell lines.     

肿瘤内皮标志物8同型物Ⅰ基因真核表达载体的构建及其在HEK293F细胞中的表达

目的:构建肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因真核表达载体,实现TEM8在HEK293F细胞中的外源表达。方法:用PCR技术扩增TEM8基因,经限制性酶切、连接、转化,插入pcDNA3.1(+)-EGFP真核表达载体,并通过脂质体将TEM8表达质粒转染至HEK293F细胞中,Western印迹检测TEM8的表达。结果:PCR扩增得到TEM8基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-TEM8-EGFP并转染HEK293F细胞,经G418加压筛选及有限稀释法得到生长性状良好、表达效率高的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293F;Western印迹证明过表达细胞系TEM8-EGFP/HEK293F显著表达TEM8蛋白。结论:构建了表达TEM8的重组HEK293F工程细胞系TEM8-EGFP/HEK293F,为进一步研究TEM8的生理功能奠定了基础。     

猪内源性反转录病毒囊膜基因env真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建猪内源性反转录病毒(PERV)囊膜基因env的真核表达质粒pHCMV-env并加以鉴定,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定基础。方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源PERV的env基因,将其插入pGEM-T easy载体中,构建重组质粒pGEM-T-env,酶切鉴定正确后,将pGEM-T-env与pHCMV-VSV-G表达质粒同时经EcoRⅠ酶切消化后连接,构建重组表达质粒pHCMV-env,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的质粒pHCMV-env转染HEK293T细胞,采用PCR、RT-PCR检测转染后env基因的整合和转录情况。结果:扩增得到五指山猪来源PERV的env基因,并构建了pHCMV-env真核表达质粒,转染HEK293T细胞系后,该细胞系中有目的基因的整合和转录。结论:构建了真核表达质粒pHCMV-env,并且在HEK293T细胞中能够整合并转录,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定了基础。     

New acceptor cell for transfected genomic DNA: oncogene transfer into a mouse mammary epithelial cell line.

A line of mouse mammary epithelial cells (NMuMG) has been characterized for its ability to be stably transfected with exogenous DNA. A transfection frequency of at least 1 cell per 1,000 was obtained with the pSV2neo plasmid. Several thousand G418-resistant NMuMG cell clones can easily be generated in cotransfection of genomic DNA and pSV2neo. The NMuMG cells were isolated from normal mammary glands and do not form malignant lesions when injected into nude mice. We have cotransfected NMuMG cells with pSV2neo and genomic DNA from the human EJ bladder carcinoma line, a cell line which contains an activated c-rasH oncogene. When a pool of 4,700 G418-resistant colonies was injected into nude mice, tumors were obtained. These tumors contain a transfected human rasH gene. Genomic DNA transfection into a line of mouse epithelial cells, in combination with the selection of stable transfectants and tumor induction in nude mice, can be used to screen human tumor DNA for the presence of activated oncogenes.     

猪皮肤成纤维细胞PERV体外和体内感染性的研究

为了解猪皮肤成纤维细胞PERV在体外和体内的感染性,通过建立猪皮肤成纤维细胞系,将所建细胞系与人胚胎肾293细胞体外共培养,并移植于严重联合免疫缺陷鼠(SCID鼠)皮下进行猪皮肤成纤维细胞PERV的体外和体内感染性实验。结果表明,猪皮肤成纤维细胞与人胚胎肾细胞共培养过程中,猪内源性逆转录病毒感染人胚胎肾细胞,进一步证实和拓宽了猪细胞PERV感染人细胞的范畴;猪皮肤成纤维细胞移植SCID鼠皮下后,导致SCID鼠发生猪细胞微嵌合(78．57％)和PERV在体内感染(85．71％)并且波及远离移植部位的多种组织或器官,但是并未检测出SCID鼠组织中表达PERV env RNA。这就证实了猪皮肤成纤维细胞PERV的体外感染性和在小鼠体内的感染性,但未能找到PERV在体内活跃复制的明显证据。因而,在猪异种移植过程中PERV传播的潜在危险仍然是必须高度重视的生物安全性问题。     

稳定表达重组小鼠FAPα蛋白细胞株的构建

采用RT-PCR方法从BALB/c胚鼠成纤维细胞克隆FAPα基因,将其连接至表达栽体pTd-FL-N,转化Stbl3感受态.筛选重组质粒,经酶切、PCR检测及测序鉴定,证实表达质粒构建正确.将表达载体转染HEK293细胞,经G418筛选单克隆阳性细胞,采用Western blot技术证实稳定表达FAPα细胞株构建成功.通过流式细胞术确定FAPa蛋白可定位表达于细胞膜上.