人类肥胖基因瘦素蛋白的原核表达

目的：原核表达人类肥胖基因瘦素蛋白,方法：以携人类肥胖基因的pUC119-ob为模拟,PCR扩增瘦素蛋白基因片段,并克隆到pET-32a构建重组表达质粒pET-32a-ob,经酶切和测序鉴定后,转化至大肠埃希菌DH5α中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果：测序和限制性分析均证明了pET-32a-ob的序列正确,转化的DH5α可高效表达一个30kD融合蛋白,与预期结果一致。结论：经pET-32a-ob转化的DH5α可有效表达重组人类瘦素蛋白,为进一步研究瘦素蛋白的生物活性提供了基础。     

香菇C91-3菌凋亡相关基因24414功能域片段原核表达载体的构建

目的构建高效快速且方便的His-标签原核表达体系,对香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域进行克隆。方法根据香菇C91-3凋亡相关基因24414的基因序列,分别设计特异性上下游引物,采用PCR方法,以24414基因序列为模板,扩增出24414基因的功能域序列。并将功能域基因连入pMD19-TSimpleVector克隆载体中,进行蓝白斑筛选,挑选出阳性菌落,提取质粒经双酶切及PCR验证后,进行基因测序。将克隆载体上目的基因连入pET-32a原核表达载体,构建重组质粒。转化入E．coli JM109宿主菌,经双酶切验证后,进一步测序鉴定验证重组质粒。结果PCR扩增出大小为747bp的基因片段,测序结果显示与香菇C91-3,凋亡相关基因24414的功能域片段同源性为100％,并成功构建了原核表达体系。结论重组原核表达载体pET-32a-24414的成功构建为进一步研究香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域的表达纯化及生物学活性奠定了基础。     

轮状病毒VP7基因的克隆与表达

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增轮状病毒VP7基因,并将其克隆到pMD18-T simple载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定DNA全序列。结果显示,克隆片段全长为981 bp。将轮状病毒VP7基因定向的克隆到原核表达载体pET-32a启动子下游,构建原核表达载体pET-32aVP7。将质粒pET-32aVP7转化Transetta表达菌株进行诱导表达,裂解菌体细胞抽提蛋白质进行SDS-PAGE。结果表明,轮状病毒壳蛋白VP7基因在Transetta表达菌株内得到成功表达。     

宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化

目的利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件。方法利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL（BLCAP）SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32（a）中,从而构建原核表达重组质粒pET-32（a）-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化回收,并采用SDS—PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28ku的融合蛋白,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建了pET-32（a）-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的克隆表达及表达产物免疫原性的鉴定

目的：克隆表达恶性疟原虫（Hasmodium falciparum,p．f）海南株（FCC1／HN）乳酸脱氢酶（LDH）,并对其免疫原性进行鉴定．为制备抗LDH抗体用于胶体金法快速检测疟原虫奠定基础。方法：应用PCR技术对恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHpf）基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-32a（＋）,重组表达载体经鉴定后诱导表达;重组LDHpf（rLDHpf）经纯化后,免疫家兔制备兔抗rLDHpf免疫血清,间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达产物的免疫原性。结果：构建了pET-32a／LDHpf重组表达载体,测序后同源性分析显示p．f不同株间LDH氨基酸序列同源性大于98％,不同种间同源性也在90％以上;间接免疫荧光和Western印迹分析显示rLDHpf具有较好的免疫原性。结论：LDHpf基因高度保守;rLDHpf得到高效表达并具有良好的免疫原性。     

小鼠c-Myc基因的克隆表达及其纯化

目的:克隆小鼠c-Myc基因,构建原核表达载体并对其进行蛋白表达及纯化。方法:以TetO-FUW-OSKM质粒为模板经PCR扩增c-Myc基因,再通过基因重组技术与pET-3C载体相连转化大肠杆菌DH5α。经抗性筛选,PCR鉴定阳性重组子,测序正确后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定分析。结果:DNA电泳结果证实PCR扩增产物与预期大小一致,DNA测序结果显示与GenBank公布的c-Myc基因序列一致,IPTG诱导SDS-PAGE电泳后,在分子量64kDa左右出现诱导后蛋白新增条带,与预测的c-Myc分子量大小一致。结论:成功地构建了pET3C-Myc原核表达载体,表达并纯化出了c-Myc蛋白,为今后研究c-Myc蛋白及相关蛋白诱导体细胞成多能干细胞打下基础。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.     

树鼩白细胞介素6的原核表达、纯化及免疫原性鉴定

目的:克隆树鼩白细胞介素6(IL-6)基因,在大肠杆菌中高效表达、纯化,并鉴定免疫原性。方法:根据GenBank预测的树鼩IL-6基因序列设计引物并扩增基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建的重组表达质粒pET-30a(+)-IL-6转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达;表达的融合蛋白经Ni柱纯化后,Western印迹和ELISA检测其免疫原性,并检测不同组织中IL-6的分布情况。结果:酶切及测序证实重组表达质粒pET-30a(+)-IL-6构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为29×10~3,纯化后复性的重组蛋白纯度可达95%以上,免疫兔子后Western印迹和ELISA鉴定其具有免疫原性,在气管、心、脾、肾中能检测到IL-6。结论:在大肠杆菌中高效表达了重组树鼩IL-6,纯化复性后具有良好的免疫原性。     

建鲤leptin两种原核表达载体的构建和表达

使用SignalP-4.0软件预测信号肽剪切位点,设计引物扩增建鲤(Cyprinus carpio var.jian)leptin基因(jlLEP-A1,jlLEP-B)不含信号肽的ORF区域。扩增产物分别连接到pET-32a(+)和pGex-4T-1原核表达载体,构建重组质粒,测序验证插入位点的正确性。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白pET-32a(+)/jlLEP-A1,pET-32a(+)/jlLEP-B和pGex-4T-1/jlLEP-A1,pGex-4T-1/jlLEP-B。结果表明,在37℃和1 mmol/L IPTG的条件下诱导5 h,重组蛋白表达量最大。SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以可溶蛋白形式存在。这一结果为后续的建鲤leptin基因功能研究奠定了基础。     

SHV-59型β-内酰胺酶的克隆与表达

目的构建SHV-59型β-内酰胺酶的表达载体。方法抽提菌株的质粒,应用PCR扩增SHV-59基因全长编码序列,扩增产物经NdeI、XhoI酶切后连接至pET-26b（＋）表达载体,重组质粒经酶切及DNA测序确证后,转入大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。超声破碎法提取表达蛋白产物,检测其活性,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点（PI）。结果PCR扩增获得879bp的产物,重组表达载体经NdeI、XhoI酶切及DNA测序后表明,目的基因已成功接入表达载体,重组菌的粗提物经头孢硝噻吩检测显示具有β-内酰胺酶活性,表明载体[pET-26b（＋）／SHV-59]构建成功。目的等电点为7．6。结论β-内酰胺酶SHV-59在原核表达细胞中实验了基因重组表达,为进一步分析酶的特性提供条件。     

水稻生长素结合蛋白ABP1的原核表达及纯化

生长素结合蛋白能够与生长素特异性结合,因而有可能直接被用作生长素免疫分析和生物传感测定中的高特异性、高亲和力识别分子.本研究通过RT-PCR获得水稻生长素结合蛋白1(ABP1)cDNA,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,成功构建pET-32a-ABP1 重组表达载体.经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性...     

海洋微生物信号降解酶基因aiiA克隆与表达载体的构建

根据已知的微生物信号降解酶基因aliA的序列设计、合成特异性引物探针,以从海洋分离的微生物ZD02的基因组为模板,PCR扩增编码蛋白alia信号降解酶的基因aliA序列,产物经PCR验证后用于构建克隆载体pMD18-ZD02aiiA,并以此克隆载体为模板,以带酶切位点的引物扩增基因,经BamHI和EcoRI双酶切后将其插入表达载体pET-17b,构建原核表达质粒pET—ZD02aiiA。经酶切、PCR鉴定及序列测定等,结果表明：克隆基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框正确,为海洋微生物ZD02信号降解酶基因的体外重组和诱导表达研究打下基础。     

OKP-B-13型β-内酰胺酶的克隆与表达

目的构建OKP-B-13型β-内酰胺酶的表达载体。方法抽提菌株的质粒,应用PCR扩增OKP-B-13基因全长编码序列,扩增产物经Nde I、Xho I酶切后连接至pET-26b(+)表达载体,重组质粒经酶切及DNA测序确证后,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。超声破碎法提取表达蛋白产物,检测其活性,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点(pI)。结果PCR扩增获得879 bp的产物,重组表达载体经Nde I、Xho I酶切及DNA测序后表明,目的基因已成功接入表达载体,重组菌的粗提物经头孢硝噻吩检测显示具有β-内酰胺酶活性,显示载体[pET-26b(+)/OKP-B-13]构建成功。目的等电点为7.1。结论β-内酰胺酶OKP-B-13在原核表达细胞中实验了基因重组表达,为进一步分析酶的特性提供条件。     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

PHD2基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b（＋）制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因。采用In-Fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达。用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。结果成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。结论实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础。     

沙眼衣原体L2型主要外膜蛋白的原核表达及其抗原性分析

克隆表达沙眼衣原体(Ct)L2血清型的主要外膜蛋白(MOMP)基因,并鉴定重组MOMP(rMOMP)的抗原性,为进一步研究Ct感染的诊断和预防技术奠定基础。应用PCR技术对CtL2型标准株的MOMP基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-32a(+),成功构建了rMOMP-pET-32a(+)表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后摇菌进行rMOMP的诱导表达、鉴定和纯化,免疫印迹和ELISA法分析显示rMOMP可与兔源抗CtL2多克隆抗体发生特异性反应,表明rMOMP具有良好的抗原性。     

棉铃虫核多角体病毒iap3基因表达时相分析

目的:原核表达棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)iap3基因,制备该蛋白的多克隆抗体,并利用该抗体分析iap3基因在病毒感染过程的表达时相,为深入研究提供基础.方法:PCR扩增iap3基因后,克隆至pET28b,转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,利用亲合层析进行蛋白纯化,将纯化融合蛋白免疫大鼠制备抗血清,利用抗血清Western blot检测IAP3在病毒感染过程的表达时相.结果:成功在原核细胞中表达iap3基因,并获得纯化的融合His - tag的IAP3蛋白,制备了该蛋白的多克隆抗体.发现iap3基因最早在感染后24h表达,到72h到达表达高峰.结论:获得了IAP3多克隆抗体,iaP3基因是一个晚期表达基因.     

重组人钙网蛋白的克隆与原核表达

［摘要］目的: 克隆人钙网蛋白（calreticulin,CRT）并在E.coli中原核表达和纯化。方法：采用RT-PCR 法从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人钙网蛋白cDNA,构建CRT原核表达质粒（pET-15b/CRT）并转化E.coli 的Rossetta菌株。IPTG诱导后,表达蛋白在变性条件下经Ni-NTA 树脂亲和层析纯化,然后透析复性。分别用SDS-PAGE和Western blotting法鉴定CRT表达和纯化状态。结果：从A549细胞总RNA中成功获得人CRT cDNA克隆,重组质粒pET-15b/CRT构建正确。转化pET-15b/CRT的E.coli Rossetta诱导性表达重组人CRT蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功建立了CRT原核表达和纯化的实验方法,该方法为后续的CRT蛋白功能研究奠定了基础。     

抑菌蛋白Reg3A的表达纯化与功能

利用原核表达系统表达人源抑菌蛋白Reg3A,经包涵体的复性和纯化获得有体外抑菌功能的活性抑菌蛋白,并对其体外抑菌功能进行初步研究。构建Reg3A原核表达载体PET-32a-Reg3A转化补充稀缺tRNA基因的表达菌株大肠杆菌BL21-Codonplus,阳性重组子采用诱导培养基诱导5h后,采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白,经包涵体蛋白的纯化和透析复性后通过Ni-NTA亲和层析交换柱,获得纯度达95%的蛋白质。Western blot鉴定显示在15 kD处有特异性条带。使用纯化后的蛋白进一步进行抑菌圈实验和抑菌活性实验,对获得蛋白的体外抑菌活性进行评估,从而为进一步进行Reg3A蛋白功能的评估及应用奠定基础。