籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因的克隆及其特征分析

丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)是C4植物在光合过程中的关键限速酶之一。本研究采用RT-PCR技术,从籽粒苋叶片中克隆到籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶基因cDNA全长。核苷酸序列分析表明,该基因cDNA序列开放阅读框全长为2 871 bp (GenBank登录号:JF907701.1),可编码956个氨基酸,分子量为104 kD。籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶PPDK与长寿花(Kalanchoe fedtschenko)、冰叶日中花(M.crystallinum)和板栗(Castanea mollissima)等双子叶植物PPDK的同源性较高,分别为82.5%、82.0%和81.4%;与稗草(Echinochloa crusgalli)、高粱(Sorghum bicolor)和玉米(Zea mays)等单子叶植物PPDK的序列一致性分别为74.5%、74.5%和73.9%。进化树分析表明,其与禾本科植物长寿花最为接近。半定量RT-PCR研究表明,该基因受光诱导而上调表达,且在绿色叶片中的表达水平最高。克隆籽粒苋PPDK基因将为今后作物高光效分子育种提供备选基因。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

异色瓢虫海藻糖合成酶基因的克隆及低温诱导表达分析

海藻糖是昆虫的血糖, 在昆虫体内主要通过海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）催化合成。本研究通过同源克隆和cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends, RACE） 技术, 从异色瓢虫Harmonia axyridis中克隆得到了TPS基因的cDNA全长序列, 命名为HaTPS（GenBank登录号： FJ501960）, 全长2 949 bp, 包含3′非翻译区为505 bp, 5′非翻译区为26 bp, 开放阅读框长2 418 bp, 共编码805个氨基酸。软件分析显示该基因编码蛋白的分子量为90.58 kD, 等电点为7.01, 包含两个糖基化位点, 无信号肽和跨膜结构。同源比对分析发现, 昆虫中TPS基因高度保守, 包含两个保守的结构域。同时, 采用实时荧光定量PCR技术对异色瓢虫HaTPS在不同发育阶段、 低温诱导条件下的表达量进行了研究。结果表明： HaTPS在预蛹期的表达量最高; 在短时低温诱导条件下, HaTPS的表达量随着温度的降低而显著升高, 在降温和升温处理条件下, HaTPS的表达量呈现先升高后下降的表达趋势。结果表明, TPS基因在昆虫抗逆中起到了重要的调节作用。昆虫经过低温诱导, 其TPS基因的调控能力得到提升。     

小黑杨环锌指蛋白基因的克隆与表达分析

用cDNA-AFLP技术从小黑杨中克隆与盐胁迫反应相关的cDNA片段,进一步应用RACE技术克隆出具有完整开放读码框的小黑杨环锌指蛋白基因（PsnRZF）,该基因全长1061bp,其中5非翻译区为184bp,3非翻译区为82bp,开放读码框为795bp,编码264个氨基酸,预测蛋白的分子量为30.25kDa,理论等电点为8.04。实时定量PCR检测的结果显示,正常生长条件下该基因在根、茎、叶中都表达;NaCl胁迫下,该基因在根、茎、叶中的表达量升高。在叶中的表达量随着处理时间的延长而逐渐升高,胁迫处理后第6天表达量达到最高。     

凡纳滨对虾DNaseⅠ基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR和RACE技术,从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中克隆了DNaseⅠ基因的全长cDNA序列。该序列全长1614bp,包含1209bp的开放阅读框,编码一个含403个氨基酸的蛋白;5′非翻译区为116bp,3′非翻译区为289bp。实时定量PCR分析结果表明,DNaseⅠ基因在肝胰腺的表达量是其他器官表达量的16～162倍,表明凡纳滨对虾DNaseⅠ基因属于胰腺型表达。本研究还利用酶切重组构建原核表达载体,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达出了有活性的重组DNaseⅠ蛋白。     

籽粒苋丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因的密码子偏好性

运用CHIPS、CUSP和CodonW等程序分析了双子叶C₄植物籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因的密码子偏好性, 并与马铃薯(Solanum tuberosum)和苜蓿(Medicago truncatula)等双子叶植物及水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)等单子叶植物进行了比较, 建立了聚类树状图, 以期在作物高光效基因工程中为籽粒苋PPDK基因选择合适的受体植物提供依据。研究结果表明, 籽粒苋PPDK基因偏好于以A或T结尾的密码子, 与其它几种被比较的双子叶作物的PPDK基因密码子偏好性趋势一致, 而玉米和水稻等单子叶植物更偏好使用以G或C结尾的密码子。PPDK基因密码子使用偏好性的系统聚类分析表明, 籽粒苋与马铃薯和苜蓿等双子叶植物聚为一类, 而稗草(Echinochloa crusgalli)、玉米和高粱(Sorghum bicolor)等单子叶植物聚为一类, 与系统进化地位一致。但单子叶植物水稻的密码子偏好性与籽粒苋较为接近, 与玉米和高粱相差较远。为了选择合适的蛋白质表达系统, 比较并分析了籽粒苋PPDK基因的密码子偏好性与大肠杆菌(Escherichia coli)及酵母菌的异同, 发现其与酵母菌的差异小于大肠杆菌, 表明选择酵母菌表达系统更为合适。     

糜子抗旱节水相关基因PmMYB的克隆及表达分析

根据在糜子抗旱节水分子基础研究中获得的一个糜子MYB基因的EST序列, 以其序列及水稻MYB18基因的序列为基础设计引物, 扩增得到1 739 bp的全长基因组序列。序列分析表明, 其包含121 bp(347~467 bp)和93 bp(599~691 bp)的两个内含子, 3个外显子; 全长cDNA序列为1 525 bp, 其中3′非翻译区为212 bp, 5′非翻译区为41 bp, 编码区为1 272 bp, 共编码424个氨基酸, C-端存在一个丝氨酸(Ser, S)丰富区。该基因具有两个典型的MYB类转录因子基因的DNA结合区(DNA-binding domain), 分别为13~63、66~114位氨基酸, 属于典型的R2R3-MYB转录因子。对其与水稻、玉米、火炬松、拟南芥、辣椒、陆地棉、大麦及茄子等9种植物的MYB基因的R2、R3重复区的氨基酸序列多重比较, 表明R2R3重复序列在植物中具有较高的保守性; 基于氨基酸序列的编码区系统进化树分析表明, 不同植物的MYB基因遗传分化很大, 序列相似性为32%~84%, 其中糜子MYB基因与水稻的MYB18相似程度最高(84%), 与大麦和玉米的相似性分别为46%和41%。通过半定量RT-PCR对其表达模式分析表明, 该基因在水分胁迫和干旱后复水条件下上调表达, 与糜子抗旱节水紧密相关。该基因的克隆为进一步探讨利用该基因改良其他植物的抗旱节水性奠定了良好的基础。     

家蝇抗菌肽Attacin-2基因的克隆、序列分析和诱导表达

攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一, 在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domestica EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2) cDNA序列。其全长819 bp, 包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF), 以及42 bp的5′末端非翻译区(5′-UTR)和51 bp的3′末端非翻译区(3′-UTR), 编码241个氨基酸残基, 推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建的系统关系表明, 家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达, 结果显示, 在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h, 家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达, 表达水平随诱导时间的不同而变化, 提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。     

水稻(Oryza sativa L.)苹果酸酶(OsNADP-ME3)基因在逆境下的表达特性研究

水稻苹果酸酶（NADP-ME）是多基因家族,由3个胞质型NADP-ME和1个质体型NADP-ME构成。本研究针对水稻胞质型成员（命名为NADP-ME3）（NM₀01061367）进行初步的功能解析。克隆获得的NADP-ME3基因的cDNA序列全长为2240bp,其中5’非翻译区为151bp,3’非翻译区为376bp,开放读码框（ORF）长1713bp,编码570个氨基酸。为研究NADP-ME3在逆境胁迫下的表达量变化,Northern blot检测结果显示,在NaCl、NaHCO3和PEG胁迫条件下,NADP-ME3随胁迫处理时间的不同表达量呈现不同程度的变化,推断NADP-ME3可能与非生物胁迫有应答关系,将NADP-ME3转入拟南芥中并通过观察转基因拟南芥在非生物胁迫下表型变化,发现NADP-ME3能够在一定程度上提高植物对非生物胁迫的耐受性。     

棉铃虫几丁质合成酶1基因的时空表达分析及氟啶脲对其表达的影响

本研究旨在明确棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)几丁质合成酶1(HaCHS1)基因在不同发育时期和不同组织的表达及氟啶脲处理后对该基因表达的影响。利用RT-PCR和RACE技术克隆获得棉铃虫HaCHS1基因,HaCHS1基因全长为5247 bp,其中开放阅读框4698 bp,编码1565个氨基酸,5′非翻译区为168 bp,3′非翻译区为381 bp。预测蛋白的相对分子质量为180.7 kDa,等电点为6.50,HaCHS1具有16个跨膜螺旋和6个N-糖基化位点。RT-qPCR检测结果表明,HaCHS1基因在预蛹期表达量最低,在蛹期第1天表达量最高。HaCHS1基因在头部的表达量最高,其次是表皮,而在中肠、气管、马氏管和脂肪体中的表达量均极低。亚致死浓度(60 mg/L)氟啶脲处理后,棉铃虫HaCHS1基因呈现出“抑制-激活-再抑制”的波动。本研究将为棉铃虫HaCHS1基因功能的研究奠定基础,为基于几丁质合成途径设计新药提供科学的理论依据。     

籽粒苋苹果酸酶基因克隆及分析

NAD/NADP-苹果酸酶(NAD-ME/NADP-ME)是C4植物光合途径的关键酶。采用RT-PCR技术对籽粒苋NAD-ME基因进行克隆,获得了籽粒苋NAD-ME基因的cDNA序列。结果表明,该序列开放可读框长度为1 872 bp,编码623个氨基酸;多序列比对和进化树分析表明,该基因核苷酸序列与其他植物已报道的NAD-ME/NADP-ME基因的核苷酸序列一致性高达75.1%~80.6%,其氨基酸序列与其他植物的NAD-ME/NADP-ME蛋白一致性为73.2%~80.3%。对推断氨基酸序列的蛋白保守区、疏水性/亲水性、潜在跨膜片段、信号肽、蛋白固有无序化和蛋白二级结构分析表明,该蛋白具有苹果酸酶的保守区、兼具亲水性和疏水性,并且含有无序结构域,可能是一种跨膜的非分泌性蛋白。     

黄粉虫热休克蛋白70基因的克隆、序列分析与表达（英文）

为给黄粉虫Tenebrio molitor抗逆机理研究提供理论依据, 本研究采用PCR和RACE法从黄粉虫幼虫中克隆出一个热休克蛋白70基因Tmhsp70, 并运用半定量RT-PCR法检测其在黄粉虫不同发育阶段的mRNA表达水平。结果表明： 克隆出的Tmhsp70 序列全长2 282 bp, 具有一个富含A的115 bp 5′ 非翻译区和一个1 935 bp的开放阅读框及一个富含A、 T的232 bp 3′-非翻译区。5′-非翻译区含有7个热休克元件nGAAn, 3′-非翻译区末端有长22 bp的Poly(A)尾。Tmhsp70编码的黄粉虫热休克蛋白（TmHSP70）具有3个典型的HSP70特征基序（IDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKIQQ）和1个胞质HSP70末端特征基序（EEVD）, 无信号肽和跨膜区域, 包含2个主要的结构域, 即： N-端42 kDa的高度保守ATPase功能域和C-端18 kDa的保守多肽结合功能域。ATPase功能域的三级结构由2个大球形亚功能域组成, 具有1个核苷酸结合中心; 多肽结合功能域形成1个双层4股β-折叠片样的三明治结构和2个α-螺旋, 内含1个多肽结合通道。此外, 黄粉虫Tmhsp70 mRNA的表达具有热激诱导和发育调控的特征。半定量RT-PCR分析表明, 42℃热激1 h的黄粉虫各发育阶段Tmhsp70 mRNA的表达量上升了1.4~26.9倍。25℃下1日龄黄粉虫蛹中的Tmhsp70 mRNA 表达量要高于其余各发育阶段的累积表达量; 42℃热激1 h 后90日龄幼虫中的Tmhsp70 mRNA 表达量最丰富, 既高于30日龄和60日龄幼虫中的累积表达量, 也高于15日龄和30日龄成虫中的累积表达量。这些结果为进一步研究黄粉虫热休克蛋白的结构、 功能和表达调控及其与抗逆性的关系奠定了基础。     

苋菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究

通过ＰＣＲ从苋属植物千穗谷（Ａmaranthus hypochondriacus)的总ＤＮＡ中扩增出苋菜凝集素（ＡＨＡ）的核基因片段。序列分析结果表明该基因为２４５３bp,含有－１５３８bp的内含子和两个分别为２１２bp和７０３bp的外显子。采取反向ＰＣＲ的方法获得仅含该基因的编码区克隆。以此为基础与二元表达载体pBin438构建含内含子与不含内含子ＡＨＡ基因的植物表达载体pBAHAg和pBAHAc并通过土壤农杆菌介导转了化烟草,转化再生植株的ＰＣＲ和Southern blot分析表明,ＡＨＡ基因已整合到烟草的染色体中,有单贝和多拷贝的整合。用与ＡＨＡ蛋白高度同源的ＡＣＡ蛋白的抗血清进行了免疫斑点（Immunodot blot)检测,结果初步表明转基因烟草有ＡＨＡ蛋白的表达,虫试结果表明转pBAHAg和pBAHAc烟草对蚜虫的平均抑制率分别达５７．２％和４８．８％,有的高达９０％以上,含内含子和不含内含子的ＡＨＡ基因在转基因植株中的抗蚜性不同。     

一色齿毛菌锰过氧化物酶2基因克隆及生物信息学分析

摘要 锰过氧化物酶（manganese peroxidase,MnP）是由一系列同功酶组成的木质素降解酶。我们前期工作克隆了一色齿毛菌（Cerrena unicolor) MnP1基因序列。在此基础上,本研究采用简并PCR、染色体步移和RACE等技术对C. unicolor mnp2基因(Cu-mnp2)序列进行克隆。同时,采用生物信息学软件对Cu-mnp2的基因结构、Cu-MnP2的蛋白质结构及多物种MnPs蛋白质序列的系统进化关系进行分析。克隆得到3 053 bp的Cu-mnp2 DNA序列(GenBank:JX270806.1)和1 429 bp的Cu-mnp2 cDNA序列(GenBank: JQ782580.1)。序列分析结果显示,Cu-mnp2 DNA序列包含14个外显子和13个内含子,启动子区域包含TATA-BOX、SP1和AP1等作用元件;Cu-mnp2 cDNA序列包含71 bp的5′UTR、230 bp的3′ UTR以及1 128 bp的开放阅读框(ORF)。Cu-mnp2 ORF序列的BLAST比对结果表明,Cu-mnp2与Trametes versicolor FP-101664 SS1 mnp序列覆盖度为53%,序列相似性为65%;与Heterobasidion irregulare mnp、C. unicolor mnp1等cDNA序列都有较高的序列相似性。Cu-mnp2的ORF编码(GenBank:AFK91530.1)由340个氨基酸残基组成的多肽链(Cu-MnP2)。Cu-MnP2蛋白质序列的BLAST比对和蛋白质三维结构均显示,Cu-MnP2包含Mn ²⁺ 、Ga ²⁺ 、血红素及芳香底物结合位点。对包含Cu-MnP1、Cu-MnP2蛋白质序列在内的多物种MnPs蛋白质序列的系统发育分析表明,多物种的MnPs分为两大类群,分别为包含4个二硫键的短MnPs和包含5个二硫键的长MnPs。其中,Cu-MnP1与Cu-MnP2均属于短MnPs,Cu-MnP2与Trametes versicolor MrP 的蛋白质序列亲缘关系最近。通过Cu-mnp2基因的克隆和序列分析,对继续研究C. uniclor的MnP同工酶基因结构和功能奠定基础。     

中国苋属nrDNA的ITS序列分析及其系统学意义

运用ＰＣＲ直接测序法,对苋属（Ａｍａｒａｎｒｈｕｓ Ｌ．）１５个种及外类群鸡冠花（Ｃｅｌｏｓｉａ ｃｒｉｓｔａｔａ Ｌ．）ｎｒＤＮＡ的ＩＴＳ区（包括ＩＴＳ－１,５．８５ｒＤＮＡ和ＩＴＳ－２）进行序列测定。结果表明苋属植物的ＩＴＳ序列总长度为６２９－６３２ｂｐ,长度变异仅发生在ＩＴＳ－１区（２５０－２５３ｂｐ）。采用ＰＡＵＰ软件进行系统发育分析表明：分布于中国的苋属植物可分为３组,即刺苋组（ｓｅｃｇ     

Sequence Analysis of the ITS Region of Nuclear Ribosomal DNA (nrDNA) in Chinese Amaranthus and Its Systematic Utility

The sequences of the ITS region (including ITS-1, 5.8S rDNA and ITS-2) of nuclear ribosomal DNA from 15 species of the genus Amaranthus L. and outgroup Celosia cristata L. were determined. The result shows that the size of the ITS region of Amaranthus is from 629 to 632 bp, and the length variation is only found in ITS-1 (250-253 bp). On the basis of phylogenetic analysis of nucleotide sequences, the Amaranthus species in China may be devided into three sections, viz., sect. Spinosus, sect. Amaranthus and sect. Paucestamen; the cultivated species, viz., Amaranthus paniculatus L., A. cruentus L., A. caudatus L. and A. hypochondriacus L. can be treated as the subsp. of A. hybridus L.; A. taishanensis F.Z.Li and A. tenuifolius Willd are both closely related to species in the sect. Paucestamen. The study also indicated that the number of stamens has more phylogenetic information than other characters, such as the number of sepals and dehiscence/indehiscence of fruits in Amaranthus.     

小麦Na+/H+反转运蛋白基因的克隆和特性

以水稻(Oryza sativa L.) Na+/H+反转运蛋白cDNA片段为探针,从小麦盐胁迫cDNA文库中筛选和克隆了2个小麦Na+/H+反转运蛋白基因,分别命名为TaNHX1 和 TaNHX2.序列分析表明TaNHX1为2 029 bp,包含一个完整的1 638 bp的ORF,编码546个氨基酸,其中含有DIFFIYLLPPI跨膜区.TaNHX2为1 693 bp,包含部分ORF及808 bp的3′-UTR.这2个基因与已知的水稻、拟南芥(Arabidopsis thialiana)和滨藜(Atriplex gmelini)中的同类基因NHX的相似性约为70%.RT-PCR分析表明小麦苗经400 mmol/L NaCl处理1 h后,TaNHX1的转录水平有所提高.     

青虾咽侧体抑制激素基因全长cDNA序列的克隆及表达分析

咽侧体抑制激素(Allatostatin, AST)是一类由几至几十个氨基酸构成的神经肽类激素, 在甲壳动物中刺激下颌器官合成甲基法尼酯, 影响甲壳动物的蜕皮和生殖。然而AST基因在甲壳动物中的克隆和表达却罕见报道。研究克隆了青虾的AST基因全长cDNA序列, 在甲壳动物中使用荧光定量PCR技术检测了AST基因在不同组织中的表达。青虾AST基因cDNA全长2995 bp, 包括242 bp的5′非编码区(UTR), 647 bp的3′UTR, 2106 bp的开放阅读框(ORF)。开放阅读框编码701个氨基酸, 可转录翻译出35个AST多肽, 在C末端都具有相同的Y/FXFGL-amide结构, 属于A型-AST。氨基酸序列比对显示保守氨基酸为Tyr、Ala、Phe、Gly、Leu。蛋白相似度比对显示, AST多肽在无脊椎动物的进化中是相对保守的。系统进化树分析表明, 青虾AST多肽与罗氏沼虾聚在一起, 具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示, AST基因在所有被检测组织中均有表达, 由高到低依次为: 肝胰脏>肠道>精巢>脑>心脏>卵巢。对青虾AST基因全长cDNA序列克隆和表达的研究为更进一步的了解AST多肽在青虾中的重要功能奠定了基础。     

Cloning and analysis of non-specific cytotoxic cell receptor (NCCRP)-1 from common carp Cyprinus carpio L

Nonspecific cytotoxic cell receptor protein (NCCRP-1) provides an important function in target cell recognition and activation of cytotoxicity. NCCRP-1 has been cloned from common carp Cyprinus carpio L. from fish barbel by EST analysis. The isolated gene is composed of 945 bp with a 79 bp 5' UTR, 714 bp open reading frame and 152 bp 3' UTR. The predicted NCCRP-1 gene is composed of 237 amino acid residues and its predicted signal peptide is 19 amino acid residues in length. This gene has conservation of all the related domains characteristic to the NCCRP-1 gene in fish. Phylogenetic and genomic analyses showed that carp NCCRP-1 was similar to other fish orthologues. The expression of NCCRP-1 gene was constitutive in both lymphoid and non-lymphoid tissues. Furthermore, by semi-quantitative RT-PCR studies, we showed that NCCRP-1 gene expression is increased in anterior kidney challenged with Aeromonas hydrophila.