籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因的克隆及其特征分析

丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)是C4植物在光合过程中的关键限速酶之一。本研究采用RT-PCR技术,从籽粒苋叶片中克隆到籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶基因cDNA全长。核苷酸序列分析表明,该基因cDNA序列开放阅读框全长为2 871 bp (GenBank登录号:JF907701.1),可编码956个氨基酸,分子量为104 kD。籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶PPDK与长寿花(Kalanchoe fedtschenko)、冰叶日中花(M.crystallinum)和板栗(Castanea mollissima)等双子叶植物PPDK的同源性较高,分别为82.5%、82.0%和81.4%;与稗草(Echinochloa crusgalli)、高粱(Sorghum bicolor)和玉米(Zea mays)等单子叶植物PPDK的序列一致性分别为74.5%、74.5%和73.9%。进化树分析表明,其与禾本科植物长寿花最为接近。半定量RT-PCR研究表明,该基因受光诱导而上调表达,且在绿色叶片中的表达水平最高。克隆籽粒苋PPDK基因将为今后作物高光效分子育种提供备选基因。     

籽粒苋丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因的密码子偏好性

运用CHIPS、CUSP和CodonW等程序分析了双子叶C₄植物籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因的密码子偏好性, 并与马铃薯(Solanum tuberosum)和苜蓿(Medicago truncatula)等双子叶植物及水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)等单子叶植物进行了比较, 建立了聚类树状图, 以期在作物高光效基因工程中为籽粒苋PPDK基因选择合适的受体植物提供依据。研究结果表明, 籽粒苋PPDK基因偏好于以A或T结尾的密码子, 与其它几种被比较的双子叶作物的PPDK基因密码子偏好性趋势一致, 而玉米和水稻等单子叶植物更偏好使用以G或C结尾的密码子。PPDK基因密码子使用偏好性的系统聚类分析表明, 籽粒苋与马铃薯和苜蓿等双子叶植物聚为一类, 而稗草(Echinochloa crusgalli)、玉米和高粱(Sorghum bicolor)等单子叶植物聚为一类, 与系统进化地位一致。但单子叶植物水稻的密码子偏好性与籽粒苋较为接近, 与玉米和高粱相差较远。为了选择合适的蛋白质表达系统, 比较并分析了籽粒苋PPDK基因的密码子偏好性与大肠杆菌(Escherichia coli)及酵母菌的异同, 发现其与酵母菌的差异小于大肠杆菌, 表明选择酵母菌表达系统更为合适。     

靶向番茄SlACS2基因CRISPR-Cas9 sgRNA的设计和分析

番茄为呼吸跃变型果实,伴随呼吸跃变产生大量乙烯,即系统II乙烯,易使番茄果实过熟,导致腐烂变质。SlACS2是番茄系统II乙烯合成的限速酶,通过CRISPR-Cas9基因组编辑系统修饰该基因,调控系统II乙烯过量表达,将迟滞番茄过熟。本研究基于RNA-seq建立了SlACS2基因的数字表达谱,表明该基因呈果实特异性表达,在植株的根、茎、叶等部位不表达。SlACS2位于番茄1号染色体,含4个外显子和3个内含子。利用在线工具CRISPRdirect 和CRISPR-P发现第1、2、3外显子分别具有18、9和11条sgRNA。其中,sgRNA1-14和sgRNA3-8及二者的近PAM的12 nt 种子序列在番茄基因组是唯一序列,GC含量高于40%,不存在TTTT终止序列。BLAST结果表明,sgRNA1-14和sgRNA3-8与GenBank公布的8条SlACS2同源序列高度一致,位于该基因的保守区,而与SlACS4和SlACS6的同源序列存在多个SNP,预示这2条sgRNA可用于番茄不同品种SlACS2基因的靶向编辑,并可规避对SlACS家族其他同源基因的脱靶效应。