氮源对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的影响

以沪农灵芝1号为供试菌株,葡萄糖作为碳源,用硫酸铵、氯化铵、鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨和酵母粉作为氮源,研究不同种类氮源对灵芝菌丝体液态深层发酵过程的影响。首先,确定了N-10酵母自溶粉作为发酵的氮源,降低了发酵的复杂性和不确定性;其次,考察N-10酵母自溶粉不同浓度对灵芝菌丝体发酵合成灵芝三萜过程中菌丝体的生物量、葡萄糖消耗、灵芝三萜产量等方面的影响,确定了N-10酵母自溶粉的适宜添加浓度。在此基础上,采用响应面中心组合设计,对4因素最佳水平范围进行研究,结果表明,葡萄糖、N-10酵母自溶粉、磷酸二氢钾和七水硫酸镁的含量分别为31.06g/L、2.76g/L、1.77g/L和1.99g/L时,灵芝三萜的理论产量为21.166g/kg干菌丝体,实际发酵产量提高到21.153g/kg干菌丝体。与原工艺相比,新工艺的灵芝三萜产量提高了6.22%。     

油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺研究及规模化验证

灵芝三萜是灵芝中主要的活性成分之一,前期研究发现油酸可以促进灵芝三萜液态深层发酵下的发酵合成。本研究主要对油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺进行优化,并进行3L发酵罐规模的验证。通过单因素实验考察油酸的添加方式、添加时间和添加浓度对灵芝三萜的影响,结合响应面实验,获得最优工艺条件并进行验证：在发酵第32h添加1.21%高温灭菌油酸,最高灵芝三萜含量为42.69mg/g;在发酵第7h添加1.35%过滤除菌油酸,最高三萜含量为43.38mg/g,分别比对照提高2.04倍和2.08倍。在1 000mL摇瓶中添加高温灭菌油酸和过滤除菌油酸,灵芝三萜含量分别为32.18和32.48mg/g,为对照的1.96倍和1.95倍;在3L发酵罐规模下灵芝三萜含量分别为28.66和25.13mg/g,为对照的1.62倍和1.42倍。本研究系统优化了油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺条件,并在与工业生产相对应的3L发酵罐上进行验证。该研究可为灵芝三萜的规模化发酵提供重要参考和借鉴。     

油酸对灵芝液态深层发酵合成羊毛甾醇代谢流分布的影响

通过代谢通量方法在3L搅拌式发酵罐上研究了油酸对灵芝液态深层发酵代谢终产物羊毛甾醇代谢流分布的影响。结果表明,在灵芝的液态深层发酵过程中,添加油酸使合成羊毛甾醇的代谢通量提高45.29%;副产物麦角甾醇的含量由3.84 mg/g降低至0.02 mg/g;羊毛甾醇合成途径(LP)、三羧酸循环(TCA)、磷酸戊糖途径(PP)和糖酵解途径(EMP)的代谢通量比对照组分别提高了29.09%、14.52%、12.22%和2.11%。因此,添加油酸能够加强灵芝液态深层发酵过程中的整体代谢流分布,减少副产物麦角甾醇的积累,提高羊毛甾醇的代谢流量。该研究为下一步灵芝液态深层发酵中灵芝三萜得率的提高奠定研究基础。     

通气量对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的影响

采用5 L搅拌式发酵罐研究灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的扩大培养条件,考察了不同条件下的通气量对灵芝菌丝体生长、比生长速率、灵芝三萜合成、比合成速率、还原糖消耗、还原糖比消耗速率、铵根离子消耗以及铵根离子比消耗速率的影响。研究结果表明,通气量能够显著影响菌丝体的生长以及灵芝三萜的合成,当通气量为8 L/min时,菌丝体合成灵芝三萜得率和生产强度最高,分别为0.204 g/L和0.00131 g/(L·h),最大菌丝体得率达到8.77 g/L。发酵过程中菌丝体最大比生长速率为0.0704 1/h,灵芝三萜最大比合成速率为0.0256 1/h,还原糖和铵根离子最大比消耗速率分别为0.562 1/h和0.0171 1/h。     

戊糖乳杆菌发酵培养基氮源条件的优化

对戊糖乳杆菌发酵培养基的氮源条件进行了优化。通过单因素实验及响应面分析优化利用木糖高产乳酸的戊糖乳杆菌发酵培养基的不同氮源组合。优化得到的牛肉膏与柠檬酸氢二铵复合的最佳组成为牛肉膏17.72 g/L,柠檬酸氢二铵1.91 g/L,得到乳酸实际最大产量42.37 g/L。添加玉米浆与酵母粉和无机氮源复合的最佳组成为玉米浆46.54 g/L,酵母粉21.95 g/L,柠檬酸氢二铵9.95 g/L,可得到乳酸最大产量41.06 g/L。通过响应面优化减少了有机氮源的种类。牛肉膏与柠檬酸氢二铵的复合得到了更高的乳酸产量,且减少了有机氮源用量,节约了成本。玉米浆与酵母粉的复合解决了单一玉米浆造成的木糖利用速率过低的问题,同样得到较高浓度的乳酸。     

pH对灵芝液态发酵代谢物及抗氧化活性的影响

已有研究报道灵芝栽培生长的最适pH在中性偏酸环境,在碱性范围的生长及代谢情况鲜见报道。本研究主要探究广泛pH对灵芝液态发酵代谢物及其抗氧化活性的影响。采用摇瓶液态培养后分析代谢物中灵芝三萜、胞内外多糖、菌丝体蛋白及抗氧化活性等指标,系统比较灵芝菌丝体在pH值2-11的生长和代谢情况。研究结果表明,灵芝菌丝体生长、合成灵芝三萜、胞内多糖、30E胞外多糖、菌丝体蛋白和菌丝体水解氨基酸的最适pH值分别为10、3、2、7、2和2。对应结果分别为17.13 g/L、33.86 mg/g、72.73 mg/g、7.86 g/L、71.42 mg/g和107.10 mg/g。比对照分别提高28.5%、77.3%、22.4%、96.5%、97.1%和70.8%。胞内多糖组分1和组分2最高分子量均在初始pH 4,分别为1.016×10⁸ g/mol和9.280×10⁴ g/mol,胞外多糖组分1最高分子量在初始pH 10,为4.946×10⁶ g/mol;对菌丝体的总抗氧化能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力、羟自由基清除能力分析结果表明最佳的初始pH分别为3、7、9。本研究为液态发酵方式下灵芝生长及其代谢物定向调控发酵的工艺优化提供参考依据,同时发现灵芝菌丝体中优质蛋白及抗氧化活性可在功能性食品和化妆品领域推广应用。     

珍稀药用真菌——樟芝深层发酵培养条件的优化

对樟芝深层发酵培养基进行了筛选,并在此基础上对发酵条件进行了优化。以樟芝深层发酵菌丝体三萜产量为主要目标产物,确定发酵培养条件为:40g/L葡萄糖,6g/L豆饼粉,1g/L K_2HPO_4,0．5g/L MgSO4,VB_1 100mg/L,自然pH,接种量为20%,装液量为100mL/250mL三角瓶,转速100r/min,26℃恒温培养6d,胞内三萜产量达15．25mg/100mL发酵液。     

桦褐孔菌液体深层培养研究

研究了不同碳源、氮源、生长因子和无机盐对桦褐孔菌液体深层培养菌丝体产量的影响。采用“二次回归正交组合设计”对培养基进行优化,结果表明,当培养基配方为小麦淀粉水解糖100.83g/L(还原糖含量为24%)、酵母粉18.70g/L、玉米浆11.01g/L、KH2PO44.59g/L、MgSO4·7H2O1.5g/L、pH6.0,在30℃、160r/min的恒温培养振荡器上振荡培养120h,生物量可达19.80g/L。     

药用昆虫蜣螂对灵芝发酵和抗小鼠肝癌活性的影响

采用液体深层发酵方式,研究了药用昆虫蜣螂对灵芝细胞生长、关键活性产物发酵动力学和抗小鼠肝癌活性的影响。结果表明,药用昆虫蜣螂在各添加浓度下对灵芝的细胞生长均无显著促进作用;但在添加量为5g/L时,对灵芝多糖和灵芝三萜的发酵动力学有显著影响(P<0.05),在发酵第7天时,灵芝总多糖和总三萜的产量分别达到2.81g/L和539.0mg/L(对照组分别为2.25g/L和428.2mg/L)。小鼠体内抗肝癌结果表明,灵芝对照发酵物的抑癌率为41.61%,灵芝-蜣螂配合物的抑癌率为42.24%;而补加蜣螂发酵后的灵芝加蜣发酵物的抑癌率高达57.21%,与灵芝对照发酵物的抑癌率相比,提高了37.49%。研究表明,采用昆虫蜣螂补料-分批发酵后,灵芝发酵物抗小鼠肝癌的活性得到显著增强。     

猴头菌高产麦角甾醇液体发酵工艺优化

以菌丝体中麦角甾醇产量为考察指标,在单因素实验的基础上用响应面分析法考察碳源、氮源和无机盐3个因素对麦角甾醇发酵产量的影响,以获得猴头菌液体发酵产麦角甾醇最优工艺,建立高产、稳定的猴头菌液体发酵产麦角甾醇生产工艺。经响应面分析,各因素按照对响应值的影响顺序为：氮源>碳源>无机盐,且氮源对麦角甾醇产量的影响极显著,碳源和无机盐对麦角甾醇产量的影响不显著。猴头菌液体发酵产麦角甾醇最优工艺为：发酵培养基为酵母自溶粉18g/L、复合碳源14g/L（葡萄糖:麦芽浸粉,7.4:6.6,M/M）、无机盐3.9g/L（KH₂PO₄:K₂S₂O₈,2.6:1.3,M/M）;接种量为10%,培养时间为7d,在此条件下菌丝体生物量干重达11.24g/L,麦角甾醇的产量达69.79mg/L,比优化前分别提高了71.08%和81.56%。该发酵工艺重复性好,效率高,成本低,是一个稳定且可控的猴头菌液体发酵产麦角甾醇生产工艺技术方案;通过该发酵工艺得到的猴头菌发酵菌丝体麦角甾醇含量高,为相关功能营养食品的开发提供了优质资源。     

13种野生灵芝菌丝体中胞内三萜与多糖含量的比较

为探究不同野生灵芝的主要活性成分以及对野生灵芝的开发利用价值,对13种野生灵芝菌株在同一条件下进行液体发酵,采用化学分析的方法,比较菌丝体胞内三萜和多糖的含量差异。结果显示,13种灵芝菌株的三萜和多糖含量有很大差异,其中无柄紫灵芝Ganoderma mastoporum、亮盖灵芝G. lucidum和树舌灵芝G. applanatum的三萜含量较高;树舌灵芝G. applanatum、紫芝G. sinense和褐灵芝G. brownii的多糖含量较高。目前国内广泛栽培灵芝G. lingzhi的野生菌株发酵产物中的三萜和多糖含量并不是最高的,研究结果表明不同种类的野生灵芝还有进一步挖掘的潜在价值。     

分光光度法测定灵芝三萜含量的干扰因素探讨

根据药典方法,以齐墩果酸为对照品,对灵芝中含有的三萜、甾醇和脂肪酸3种类型化合物进行分光光度法测定,并对影响三萜含量测定的因素进行分析。结果表明灵芝中的甾醇和脂肪酸类化合物会干扰所有的测定结果,尤其影响灵芝孢子中三萜含量的测定。灵芝子实体中三萜化合物的结构特征,造成了其测定值远远低于真实值。因此,分光光度法不适用于测定灵芝子实体、菌丝体和孢子及其相关产品中的三萜含量。     

灵芝菌丝体三萜及其药理活性的研究进展

菌丝体作为灵芝生长发育过程中的一个特定生理阶段,会产生不同于子实体和孢子的特定结构的灵芝酸类三萜化合物。本文总结了灵芝菌丝体中已发现和鉴定的三萜化合物结构、生物活性及其构效关系的研究进展,以期为灵芝菌丝体三萜在生物合成、代谢调控等的基础研究及相关产品的开发应用提供科学参考。     

灵芝子实体中不同极性的三萜体外抗肿瘤及抗炎活性比较

为了解灵芝中不同极性三萜活性的差异,运用大孔树脂将灵芝总三萜根据极性大小进行分段,采用高效液相法分析各极性部分的HPLC指纹图谱和三萜含量,并比较其对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用和抗炎活性。结果显示D-101大孔树脂可以有效地将灵芝总三萜分为中等极性和低极性两部分,两部分的三萜含量分别为(279.00±2.90)mg/g、(94.52±2.03)mg/g。其中,低极性三萜的体外抗肿瘤活性明显强于中等极性三萜,其对K562、SW620、L1210细胞增殖抑制的IC₅₀值分别为(74.12±1.94)μg/mL、(121.45±2.13)μg/mL、(13.52±1.13)μg/mL。另外,低极性三萜对RAW264.7细胞呼吸爆发的抑制作用也明显强于中等极性三萜。进一步对低极性三萜和中等极性三萜单体的抗炎活性进行比较,发现低极性三萜灵芝烯酸F、灵芝酸DM、灵芝醇B对RAW264.7细胞呼吸爆发的抑制作用明显强于极性较高的灵芝酸C₂、灵芝酸A。该研究阐明了灵芝子实体中不同极性三萜部位的抗肿瘤及抗炎活性并不相同,为将来新药开发和灵芝质量标准的改进建立了基础。     

过表达GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）基因提高灵芝多糖的生产

灵芝多糖是灵芝的主要生物活性成分之一,具有多种药理活性,但灵芝多糖的低产量限制了其广泛应用。相关研究表明,灵芝中过表达多糖生物合成相关基因能够提高多糖产量,但过表达GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）基因提高灵芝多糖产量未有报道。本研究克隆获得了灵芝gmp基因,并成功构建出了过表达gmp基因的工程菌株（GMP菌株）,同时对野生型菌株（WT）和GMP菌株的胞内多糖（IPS）、胞外多糖（EPS）产量以及GDP-甘露糖合成相关基因甘露糖磷酸变位酶1（PMM1）基因及甘露糖磷酸变位酶2（PMM2）基因的表达水平进行了检测。研究结果表明,在悬浮发酵培养条件下,灵芝中gmp基因的过表达增加了灵芝多糖的积累。与WT菌株相比,GMP菌株的EPS以及IPS的含量最高达到了0.991g/L和21.59mg/100mg干重,比WT菌株分别提高了21.1%和19.5%。gmp基因的过表达也提高了基因pmm1和pmm2的表达。与WT菌株相比,GMP菌株中pmm1以及pmm2基因的表达水平分别上调了2.87倍和2.55倍。研究结果表明,过表达gmp基因是一种提高灵芝多糖产量的有效方法,并且过表达gmp基因提高了灵芝多糖的合成及pmm1和pmm2基因的表达。     

灵芝蛛网病病原菌及其生物学特性

为明确吉林省蛟河市灵芝Ganoderma lingzhi栽培主产区发生的疑似灵芝蛛网病的病原菌,作者通过罹病灵芝子实体病原物的分离纯化、致病性测定、形态学和分子生物学鉴定以及病原菌的生物学特性研究,证明引起吉林省蛟河市灵芝蛛网病的病原菌为嗜菌枝葡霉Cladobotryum mycophilum。该菌营养体最适生长条件为温度25℃、pH 5、蔗糖作碳源、酵母浸粉作氮源,光照对菌丝体生长有一定的抑制作用,完全黑暗最适宜生长。本文研究结果为进一步研究该病害的发生规律和防治措施提供了理论参考。     

灵芝菌丝体中一个三萜类化合物的核磁归属及活性初探

通过液体振荡-静置两阶段发酵获得灵芝菌丝体,并采用硅胶柱色谱层析、反相柱层析和甲醇重结晶的方法,从中分离得到4个三萜类化合物。根据NMR、MS等波谱数据分析,化合物分别被鉴定为lanosta-7,9(11),24-trien-3α-acetoxy-26-oic acid（1）、灵芝酸R（2）、灵芝酸T（3）和灵芝酸S（4）,其中化合物1的核磁信号全归属为首次报道。4个三萜类化合物均具有较好的抑制肿瘤细胞L1210及K562增殖的活性,且化合物1的体外抗肿瘤活性为首次证实,其对肿瘤细胞L1210及K562增殖的半数抑制浓度IC₅₀分别为22.17μmol/L和54.79μmol/L。