家蚕后部丝腺遗传物质的研究

家蚕(Bombyx mori)后部丝腺的脱氧核糖核酸(DNA)和信使核糖核酸(mRNA)直接关系到丝心蛋白(fibroin)的合成,因此引起人们较大的重视。我们从本省蚕丝生产中常用的蚕体后部丝腺中分离纯化了DNA和mRNA,并观察了它们的重要理化性质。     

家蚕后部丝腺线粒体DNA的制备

本文首次报道了制备家蚕,五龄初期幼虫后部丝腺线粒体DNA的结果。后丝腺匀浆后,以600g和15,000g差速离心,得到完整离体线粒体。在高渗条件下,以牛胰 DNase Ⅱ处理污染的核DNA。碱性SDS裂解线粒体后,经RNase处理,并通过Sepharose 2B凝胶柱分部,便得到可供电镜分析与限制性内切酶消化的线粒体DNA制品。初步结果表明,家蚕后丝腺mtDNA为环状分子。分子量较大,约为11×10~6d的2倍、3倍和4倍。每条丝腺约含0.5微克。每个线粒体约含3×10~(-3)微克,大概有2—4个拷贝。     

家蚕V型ATP酶B亚基的克隆及表达特征

V型ATP酶(Vacuolar-type ATPase)是一种定位于细胞膜和细胞器膜上的氢离子转运酶。它利用ATP水解的能量将氢离子转运到液泡、囊泡或者胞外,从而维持细胞内正常的酸碱环境。V型ATP酶B亚基(V-ATPase B)作为ATP的催化位点,也有着非常重要的作用。为了探讨家蚕V-ATPase B(Bm V-ATPase B)的功能,首先从家蚕五龄幼虫的中肠c DNA中克隆了Bm V-ATPase B基因并构建原核表达载体进行原核表达,获得了重组蛋白,经质谱鉴定正确后,通过镍柱亲和层析的方法纯化了该蛋白并制备了多克隆抗体;最后分析了该蛋白在家蚕丝腺中的表达特征并利用免疫荧光对其在丝腺中的表达位置进行了定位。结果显示Bm V-ATPase B基因序列全长1 473 bp,预测蛋白分子量55 k Da,预测等电点5.3。通过Western blotting对家蚕5龄第3天和上蔟第1天幼虫丝腺的不同区段进行Bm V-ATPase B蛋白的表达特征分析,发现在两个时期该蛋白均在前部丝腺高量表达,而在中部丝腺和后部丝腺表达量相对较低。进一步对两个时期丝腺的不同区段进行免疫荧光定位,发现该蛋白在两个时期的前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺均定位于细胞层。利用激光共聚焦显微镜对该蛋白进行进一步的定位,发现该蛋白主要在丝腺的细胞膜表达。研究结果明确了该蛋白在丝腺中的表达模式,为深入研究该蛋白在蚕丝纤维形成中的作用奠定了基础。     

蜕皮激素与丝蛋白合成:植源性蜕皮激素对家蚕后部丝腺核酸代谢的影响

给家蚕五龄幼虫添食植源性蜕皮激素(以下简称MH),对后部丝腺的核酸代谢都有直接影响,但由此引起的效应却是复杂的,与添食的时期和剂量以及蚕品种等因素有关。五龄每天低剂量(夏蚕0.5微克/头,春蚕2微克/头)连续添食和前期一次添食(2—4微克/头)对后丝腺RNA的合成都有明显的促进作用,并且RNA含量增长高峰是在五龄中期以后;每天较高剂量连续添食和中期一次添食,都表现为抑制作用。添食MH对后部丝腺DNA合成的影响与RNA的变化不尽一致;在每天0.5微克/头连续添食区表现出强烈的促进作用,而其余各处理区都出现明显的抑制。由此认为MH能直接作用于遗传物质DNA,通过调节有关基因的复制或者转录速度,从而对丝蛋白的生物合成产生某种影响。     

家蚕 Fhx/P25 基因的一种新的转录模式分析研究

家蚕 Fhx/P25 蛋白是丝素蛋白的主要成分之一,过去报道只在家蚕后部丝腺特异的转录表达 . 通过对大规模的家蚕 EST 序列分析发现, Fhx/P25 基因不仅在家蚕后部丝腺高效转录,而且在家蚕幼虫五龄第三天的卵巢组织及其他组织也有转录;分析还发现 Fhx/P25 基因在丝腺和卵巢组织中有不同的转录起始位点,在卵巢组织中的转录起始位点比在丝腺中的至少要提前 115 bp 左右 . 用 RT-PCR 和 FQ-PCR 进一步验证,以上分析结果均正确 . 分析还发现 Fhx/P25mRNA 存在选择性拼接 . 以上结果表明 Fhx/P25 基因并不是组织特异转录基因,它的转录表达存在复杂的调控机制,可能还有其他功能 .     

基于RNA-Seq分析Ras1~(CA)在家蚕后部丝腺过表达对细胞周期通路基因的影响

【目的】本文旨在挖掘野生型家蚕Bombyx mori和Ras1CA过表达转基因家蚕后部丝腺中的转录本差异,分析和验证细胞周期通路中的差异表达基因,从而探讨Ras1CA过表达转基因家蚕提高蚕丝产量的分子机制。【方法】利用转录组学比较野生型和Ras1CA过表达转基因家蚕后部丝腺中的基因转录本差异,经实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证。【结果】野生型家蚕和Ras1CA过表达转基因家蚕后部丝腺组织中有2 636个差异表达基因,其中细胞周期信号通路中有42个差异表达基因,包括细胞周期依赖性激酶(CDK)、细胞周期素(Cyclin)以及转录因子等。通过q RT-PCR检测cdk1、cyclin D1、cyclin D2、cdc7、cdh1、dp-1,2等6个基因在野生型和Ras1CA过表达转基因家蚕后部丝腺组织中的相对表达量,发现转基因家蚕中的表达量均显著高于野生型(P<0.05),其中cyclin D2的表达差异极显著(P<0.01)。q RT-PCR结果与转录本差异一致,表明Ras1CA过表达后,能够促进细胞周期通路基因的表达。【结论】野生型家蚕和Ras1CA过表达转基因家蚕后部丝腺中有大量差异表达基因,且Ras1CA能够在转录水平上调控细胞周期通路,影响后部丝腺组织的细胞分裂和器官生长,从而促进蚕丝蛋白的合成。     

蓖麻蚕后部丝腺体Poly (A)RNA的cDNA在大肠杆菌中的克隆

家蚕（B. mori）后部丝腺体丝心蛋白 mRNA及其基因克隆，前人已有报道^[6,9,11,13]. 本文介绍我们以蓖麻蚕(Attacus ricini）后部 丝腺体为材料分离出Poly(A)+RNA，通过反 转录途径将mRNA-cDNA杂双链与质粒pBR 322重组，转化大肠杆菌C600，从转化菌中筛 选出一株含有插人了外源cDNA片段的重组 克隆，并对它进行了初步鉴定。     

昆虫激素调节控制的研究——保幼激素类似物对合成甘氨酸和丙氨酸有关酶系的调节控制

五龄后期蚕丝腺后部的细胞几乎只合成蚕丝的丝心蛋白。保幼激素类似物(JHA)能增加蚕丝心蛋白的生物合成。家蚕和蓖麻蚕丝心蛋白中,甘氨酸和丙氨酸的含量约占75%。我们用ZR515和ZR777分别处理五龄蚕后,观察到丝腺后部和脂肪体中合成甘氨酸和丙氨酸有关转氨酶的活力均有明显增加。(1)用ZR515处理五龄家蚕后,使五龄期延长1～2天,茧层量增加约10%。蚕丝腺后部的丙氨酸-乙醛酸转氨酶,丙氨酸-酮丙二酸转氨酶,谷丙转氨酶和谷天转氨酶活力,JHA组均比对照组增高约10～40%,脂肪体中这些酶活力也相应地比对照组增高约30%,其中丙氨酸-乙醛酸转氨酶活力增加到165%。酶活力增加的持续时间约3～5天。(2)用ZR777处理五龄蓖麻蚕后,丝腺后部和脂肪体中的谷天转氨酶、异亮氨酸吨-α-酮戊二酸转氨酶和丙氨酸-乙醛酸转氨酶活力,均比对照组高。本文认为JHA对蚕丝腺后部和脂肪体中形成甘氨酸和丙氨酸的转氨酶有明显的调控作用,从而为丝心蛋白的合成提供更多的甘氨酸和丙氨酸。这也许是JHA增丝机制的一个重要方面。     

昆虫激素调节控制的研究——保幼激素类似物对合成甘氨酸和丙氨酸有关酶系的调节控制

五龄后期蚕丝腺后部的细胞几乎只合成蚕丝的丝心蛋白。保幼激素类似物(JHA)能增加蚕丝心蛋白的生物合成。家蚕和蓖麻蚕丝心蛋白中,甘氨酸和丙氨酸的含量约占75%。我们用ZR515和ZR777分别处理五龄蚕后,观察到丝腺后部和脂肪体中合成甘氨酸和丙氨酸有关转氨酶的活力均有明显增加。(1)用ZR515处理五龄家蚕后,使五龄期延长1～2天,茧层量增加约10%。蚕丝腺后部的丙氨酸-乙醛酸转氨酶,丙氨酸-酮丙二酸转氨酶,谷丙转氨酶和谷天转氨酶活力,JHA 组均比对照组增高约10～40%,脂肪体中这些酶活力也相应地比对照组增高约30%,其中丙氨酸-乙醛酸转氨酶活力增加到165%。酶活力增加的持续时间约3～5天。(2)用ZR777处理五龄蓖麻蚕后,丝腺后部和脂肪体中的谷天转氨酶、异亮氨酸-α-酮戊二酸转氨酶和丙氨酸-乙醛酸转氨酶活力,均比对照组高。本文认为JHA 对蚕丝腺后部和脂肪体中形成甘氨酸和丙氨酸的转氮酶有明显的调控作用,从而为丝心蛋白的合成提供更多的甘氨酸和丙氨酸。这也许是JHA 增丝机制的一个重要方面。     

家蚕Wnt信号通路下游关键基因Pangolin转录剪接体X3的克隆和分析

【目的】克隆家蚕Bombyx mori Wnt信号通路下游关键基因Pangolin isoforms A/H/I/S转录剪接体X3 (Pangolin X3),分析其序列和表达特征。【方法】从NCBI数据库检索家蚕Pangolin X3,根据其编码序列(coding sequence, CDS)设计引物,利用PCR从家蚕幼虫中肠和血淋巴中进行克隆并测序验证。利用SilkDB 3.0, SMART, 多序列比对和系统发育树分析Pangolin X3的序列特征。利用qRT-PCR分析Pangolin X3在家蚕5龄第3 天幼虫不同组织(头、血淋巴、体壁、性腺、中肠、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管)中的相对表达水平。【结果】从家蚕幼虫中肠和血淋巴克隆了Pangolin X3(GenBank登录号: XM_038020921)的CDS,其开放阅读框长1 560 bp,编码519个氨基酸残基,预测分子量为55.86 kD,预测等电点为7.53。Pangolin X3蛋白含有保守的β catenin结合位点和HMG结构域,其氨基酸序列在不同的昆虫中比较保守,特别是与DNA结合的HMG结构域,而与β-catenin结合的N末端CTNNB1结构域部分氨基酸残基发生变异。组织表达谱显示,Pangolin X3在家蚕5龄第3 天幼虫中肠、血淋巴和性腺中的相对表达水平较高,在头、体壁、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管中的相对表达水平较低。【结论】本研究克隆了家蚕Pangolin X3,分析了其序列和表达特征,为深入研究家蚕Pangolin的生物学功能提供了基础。     

蜕皮激素与丝蛋白合成:植源性蜕皮激素对家蚕丝腺蛋白质合成中3H标记甘氨酸参入活性的影响

用³H标记甘氨酸参人法证明:家蚕后部丝腺中丝心蛋白的大量合成, 是在五龄4日以后, 熟蚕时合成活性最高;中部丝腺中丝胶蛋白的大量合成, 是在五龄5日以后, 以熟前一日合成活性最高.五龄每日低剂量连续添食和前期一次添食植源性蜕皮激素(简称MH), 能促进后部丝腺对³H标记甘氨酸的吸收, 显著提高丝心蛋白的合成活性, 而抑制中部丝腺的吸收, 使丝胶蛋白的合成活性明显下降.本试验结果为阐明外源MH对丝蛋白合成的调节机理提供了直接的证据.     

家蚕丝蛋白的合成和保幼激素的调节

本实验查明家委品种的后丝腺细胞数目为1080个,在透射电镜观察下,后丝腺细胞内质网呈片层状,分布着大量的核蛋白体颗粒,细胞核内染色质成块状。用液面铺展技术显示出染色质的特别结构。每个后丝腺细胞能合成DNA0.6—0.8微克,为原来体细胞数的一百万倍,奠定了后丝腺细胞染色体的多线化的物质基础。第7天后丝腺的RNA为5.4毫克,mRNA为总RNA的1%,占细胞核RNA的2.5%,rRNA的碱基比(G+C)为53.1%,热增色效应为22.5%,融点温度?值为43.7℃。染色质丝DNA的融点温度为70.5℃,碱基比(G+C)为40.5%,并分析了染色质的DNA、RNA、组蛋白和非组蛋白的相对比值。每个后丝腺细胞合成240.6微克丝心蛋白,每个细胞每秒钟可合成6×10⁸个丝心蛋白分子。中丝腺储存的丝心蛋白为后丝腺的二十倍。 经保幼激素类似物处理后,蚕的生长期延长,体重和丝腺重量、后丝腺内蛋白质和RNA含量增高,合成丝心蛋白的功能单位——多核蛋白体在量的方面也有所提高。例如在后丝腺RNA方面,雄蚕第7天增加到6.20毫克,每个后丝腺细胞能合成丝心蛋白243.6微克。因此,我们认为,外源保幼激素能促进RNA的合成,维持后丝腺细胞的正常活动,提高多核蛋白体的合成量,从而增加丝心蛋白的合成。     

家蚕丝素蛋白轻链基因（fib-L）启动子序列的克隆及其活性分析

家蚕Bombyx mori丝素蛋白轻链（fibroin light-chain, fib-L）基因fib-L具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为了利用其启动子构建能够表达外源基因的丝腺生物工厂,本实验对fib-L启动子活性进行了研究。通过PCR法克隆了fib-L启动子元件,序列分析显示fib-L启动子由位于-33 ～ -25处的TATA盒元件和位于－128～－121处的特征性序列GTCAATTT共同组成。用fib-L启动子控制报告基因DsRed进行家蚕BmN细胞和蚕体内的瞬时表达研究,结果表明fib-L启动子可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

植物激素对家蚕后部丝腺核酸含量的影响

植物激素对家蚕后部丝腺核酸含量的影响李瑞,张雨青（苏州蚕桑专科学校,苏州２１５１５１）倪同时（江苏省海门县多种经济管理局林查指导站,２２６１００）植物激素是调节植物生长发育的物质。它对植物的生理作用及作用机理已研究得比较详细,且人工合成的植物激素类似...     

家蚕（Bombyx mori）5龄幼虫丝腺染色质在核基质上的组构

家蚕(Bombyx mori)5龄幼虫丝腺的染色质高度多倍化,整个基因组达10~5至10~6个拷贝。依次经低盐和高盐抽提5龄幼虫中丝腺、后丝腺和蚕体的细胞核,得到其核晕 (nuclearhalo),限制性内切酶消化后还有一部分DNA片段与核基质紧密结合在一起,说明染色质的组织与核基质有关。通过测定核基质上残留的DNA片段的平均长度及其在全基因组DNA中所占的百分比计算出,核晕上DNAloop的平均大小在中丝腺、后丝腺以及蚕体细胞中均为67kb左右。丝腺中高度多倍化的染色质与二倍体蚕体组织之间并不存在差异,它们同样被错定在核基质上而分隔成长约67kb的染色质loop,从而保证整个基因组的有序排列。以丝素基因为探针进行DNA印迹杂交发现,在5龄后丝腺中丝素基因特异性地和核基质紧密结合,说明核基质与丝素基因的组织特异性表达有关。     

家蚕前部丝腺特异表皮蛋白Bm11721的鉴定及表达

家蚕的丝腺是其丝蛋白合成和分泌的器官,根据其形态和功能的不同分为前部、中部和后部丝腺,前部丝腺不具有合成丝蛋白的能力,是丝蛋白构象发生转变的场所。剪切力在丝蛋白构象转变中起到重要的作用,其在家蚕前部丝腺主要由前部丝腺逐渐变细的管腔结构和富含几丁质及表皮蛋白的坚硬的内壁提供。鉴定家蚕前部丝腺新的几丁质结合蛋白,并调查其在家蚕幼虫不同组织的表达特征。通过几丁质亲和层析的方法在前部丝腺筛选并鉴定到一个新的具有几丁质结合功能的表皮蛋白Bm11721,其编码基因编号为BGIBMGA011721(Gen Bank Accession No.NM-001173285.1)。利用原核表达系统成功表达了该蛋白,通过Ni-NTA亲和层析的方法获得了Bm11721的重组蛋白并制备了多克隆抗体。组织表达分析发现无论是转录水平还是蛋白水平Bm11721均只在前部丝腺特异表达,且Bm11721蛋白在5龄期的前部丝腺中恒定表达。免疫荧光定位结果显示Bm11721蛋白定位在前部丝腺的内膜中,推测其可能与前部丝腺的机械硬度有关,为丝蛋白的构象转变提供剪切力。     

蓖麻蚕后部丝腺体Poly(A)~+RNA的cDNA在大肠杆菌中的克隆

家蚕(B.mori)后部丝腺体丝心蛋白mRNA及其基因克隆,前人已有报道。本文介绍我们以蓖麻蚕(Attacus ricini)后部丝腺体为材料分离出Poly(A)~+RNA,通过反转录途径将mRNA-cDNA杂双链与质粒pBR322重组,转化大肠杆菌C600,从转化菌中筛选出一株含有插入了外源cDNA片段的重组克隆,并对它进行了初步鉴定。     

蓖麻蚕五龄幼虫整体及几个主要器官DNA和RNA含量的变化

朱洗教授从国外引进蓖麻蚕,为我国蚕业生产做出了巨大贡献。为了更好的发展蓖麻蚕丝的生产,目前对改善蓖麻蚕经济性状的研究,逐渐引起人们的重视。我们(1981)曾将家蚕DNA注射给五龄蓖麻蚕,引起了蓖麻蚕某些遗传性状发生了变异。为了探索外源DNA诱导变异的适宜条件,有必要对这一发育时期的核酸代谢情况进行研究。Tashiro等(1968)和Shigematsu等(1978)对家蚕核酸进行研究。辜祥荣等(1981)对蓖麻蚕后部丝腺核酸含量变化进行过研究。本文研究了五龄蓖麻蚕整体和几个主要器官DNA和RNA含量的变化,同时也研究了~3H-胸腺嘧啶及~3H-尿嘧啶在不同时间对不同组织DNA和RNA的参入,现将结果报告如下。     

利用SADF法进行家蚕基因组DNA多态性分析

从家蚕品种C108和大造后部丝腺提取的基因组DNA,用PstⅠ酶解后与自己设计的人工接头相连,并用与人工接头序列相匹配的选择性引物进行选择性PCR扩增(selective amplification).扩增产物经琼脂糖电泳检测显示,用SADF法在两品种中能检测到稳定的DNA多态性片段.     

家蚕后丝腺细胞染色质的一些特性

在家蚕幼虫发育阶段,丝腺细胞的大小和脱氧核糖核酸(DNA)的含量均有巨大增长,而没有细胞分裂发生,这种DNA含量的增加是由于细胞内整个染色体组型多次全部复制的结果,因此称之为多倍化现象。细胞染色体组型的多倍化现象,也在其他生物种类中存在,可是同丝腺细胞比起来可以说是相差很大。后丝腺和中丝腺每个细胞所含DNA最高量大约是体细胞的20—100万倍。这是与它们制造和分泌大量丝蛋白相一致的。后丝腺细胞是合成丝腺的核心——丝心蛋白的主要部位。为了阐明昆虫激素是如何调节和控制丝心蛋白的合成,需要分离出一定纯度的后丝腺细胞染色质来。后丝腺细胞体积大、细胞核呈树枝状使分离工作困难。我们在这方面作了一个尝试,结果报道如下: