SV40 PolyA序列及其AATAAA信号对上游GFP基因表达及转录终止的影响

SV40 PolyA(猴空泡病毒PolyA,简称PolyA)序列是有转录终止作用和使转录的mRNA添加PolyA尾的DNA序列(240 bp),含有AATAAA六核苷酸多腺苷化信号(Polyadenylation signal)。在pEGFP-C1质粒的GFP基因下游插入14个同向串联的Alu序列(Alu14),构建pAlu14质粒,瞬时转染HeLa细胞,用Northern blot检测和荧光显微镜观察GFP RNA和GFP蛋白表达,发现Alu串联序列强烈抑制GFP基因表达,该序列没有转录终止作用产生高分子量GFP融合RNA。又在pAlu14质粒GFP基因和Alu串联序列之间按正、反方向插入PolyA序列及去除AATAAA信号的PolyA序列,插入的这些PolyA序列均能部分解除Alu14对GFP基因的抑制作用;去除AATAAA信号的PolyA正、反序列仍然引起转录终止。将PolyA反序(PolyAas)分为4段每段60 bp,中间的2段分别称为2F2R和3F3R,将2F2R或3F3R插在pAlu14质粒的Alu串联序列的上游,随着插入2F2R片段拷贝数的增加转录的GFP融合RNA的分子量增加;2F2R的下游如果依然是2F2R那么2F2R可以支持转录延伸,如果2F2R下游是Alu串联序列则2F2R导致转录终止。无论插入一个3F3R或插入64个3F3R,均产生低分子量GFP RNA。     

SV40PolyA片段串联拷贝数目影响GFP报告基因表达

Alu元件（约280bp）是人类基因组中的重要重复序列,串联Alu呈长度依赖性下调GFP报告基因表达,在Alu串联序列上游正向或反向插入SV40PolyA（简称PolyA,240bp）,解除Alu串联序列对GFP基因的抑制作用.PCR法扩增PolyA反序（PolyAas）不同位置的60bp片段,插入pAlu14质粒（14个Alu正向串联插入pEGFP-C1）的GFP基因和Alu14之间,瞬时转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察和Northern检测,1F1R（PolyAas5′端第1个60bp片段）和4F4R（自PolyAas5′端计算第4个60bp片段）不能活化基因;2F2R和3F3R（PolyAas中间的2段）可以解除Alu14对GFP基因的抑制作用.将2F2R和3F3R各自反复首尾串联,分别插入pAlu14质粒GFP基因和Alu串联序列之间,瞬时转染HeLa细胞,用插入4个2F2R的pAlu28,插入4个3F3R的pAlu18,插入4个3F3R的pAlu28作长度对照,以排除由于插入片段长度增加可能对结果造成的干扰,发现2～4个拷贝的2F2R和3F3R活化基因作用高于一个拷贝的同样片段,但是多于8拷贝以后,活化GFP基因作用减弱.本实验证明,SV40 PolyAas至少含有两段活化基因序列,活化基因序列（2F2R,3F3R）的最适活化基因条件需要合适的拷贝数.     

SV40PolyA顺式活化基因元件中不完整茎环结构的发现和序列研究

研究室的前期工作发现,Alu串连序列插入pEGFP-C1质粒的GFP基因下游,瞬时转染HeLa细胞抑制GFP基因表达,2F2R(来自SV40PolyA反序5′端的第2个60 bp)插入GFP和Alu串连序列之间可以解除Alu序列对GFP基因的抑制作用。文章通过删减2F2R发现,45R(2F2R 5′端的45 bp)、30R和22R可以活化基因,且二串连体活化基因作用高于单体。Secloop(2F2R近中部的22 bp)和Poly4(2F2R 3′端的30 bp)不能活化基因。30R与Poly4用9碱基连接形成30R-Poly4,其活化基因作用低于2F2R,两个22R之间连接碱基数对活化GFP基因作用没有明显的影响。22R(5′-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT-3′)含有不完整的回文序列,可以形成不完整的茎环结构,包括一个3碱基loop、3 bp第一茎、2碱基泡和3 bp第二茎。改变22R茎环结构的碱基突变明显影响其活化GFP基因的作用,过多互补和过少互补的茎环结构均不利于活化基因,提示适当的不完整茎环结构与活化基因有关。     

人源Alu RNA工程菌的构建和表达

目的:外源RNA导入细胞特异性上调或下调基因表达,目前外源RNA的制备方法主要有化学合成、体外转录、细胞提取。Alu DNA和Alu RNA是人基因组和转录组中最重要的成分,参与基因表达调节。建立工程菌制备基因工程人源Alu RNA(Alu RNA)的技术,所提取的RNA满足一般生物学实验要求。方法和结果:将人Alu序列插入pET-28α质粒(pET),转化BL-21菌,探讨不同条件对Alu RNA产生的影响。用pET-Alu×8质粒转化BMBL-21(DE3)感受态细胞(简称DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导减弱细菌生长;用IPTG诱导2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h和16h,用Northern杂交检测Alu RNA的量,发现诱导4小时RNA产量最高;1、2、4、8、14拷贝的Alu序列插入pET,转化DE3菌,随拷贝数增加Alu RNA产量上升;pET-Alu×8 DE3菌液,不加IPTG诱导,没有Alu RNA产生,0.1~0.4mg/ml IPTG诱导时,Alu RNA产量没有区别,偏离该浓度时,RNA产量略下降;34℃、37℃和40℃培养pET-Alu×8 DE3菌液,IPTG诱导4h,在37℃培养条件下,RNA产量最高;将pET-Alu×8质粒转化3种BL-21感受态细胞,包括DE3、BMBL21-DE3-pLysS(简称pLysS)和Trans BL 21(简称TransBL),发现转化DE3感受态细胞后Alu RNA产量最高。结论:建立了基因工程制备Alu RNA的技术:pET-Alu×14质粒转化DE3菌,37℃培养至600nm OD为1.0时,加入终浓度为0.2mg/ml的IPTG诱导4h,获得最高Alu RNA产量,纯Alu RNA在提取的RNA中的含量达15.8%,每100ml菌液纯Alu RNA产量平均为0.46mg。     

用大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组

利用大肠杆菌细胞内质粒间同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组 DNA,高效构建携带有外源基因的均一重组腺病毒 .将带有狂犬病毒糖蛋白 (GP)基因和加强型 GFP(enhanced GFP,EGFP)表达盒的重组穿梭质粒 p Ad- Track- CMV/ GP与腺病毒骨架载体质粒 p Ad Easy- 1一起同时电击共转化大肠杆菌 BJ51 83.在 BJ51 83细胞内 ,带有同源序列的重组穿梭质粒与骨架载体可进行同源重组 ,得到以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组 p Ad- GP’.以 p Ad- GP’为模板 ,经DNA测序确认 GP基因成功整合入此质粒中的腺病毒基因组 E1区外源基因表达盒中 .线形化的p Ad- GP’转染 2 93细胞后可得到基因组结构均一、在 E1区插入有 GP和 EGFP表达盒的重组腺病毒 ,病毒滴度可达 1× 1 0 8pfu/ ml.电镜下此重组病毒颗粒直径约为 70 nm,略呈球形 ,用荧光显微镜观察感染细胞有很强的 EGFP表达 .实验表明 :利用大肠杆菌同源重组获得克隆化的重组腺病毒基因组 DNA,可高效制备高滴度的均一重组腺病毒     

基于同尾酶技术构建CCL3L1 基因串联重组质粒的方法

目的:利用同尾酶技术将CCL3L1基因重复连续插入pcDNA6.2-GW/miR载体,构建含有CCL3L1基因串联体的重组质粒,实现小片段CCL3L1有效延长。方法:PCR扩增CCL3L1基因并在引物的两端设有同尾酶BamHI和BglII限制性内切酶位点,纯化PCR产物插入pMD18-T载体,阳性克隆命名为pMD18T-CCL3L1。BamHI和BglII双酶切pMD18T-CCL3L1和pcDNA6.2-GW/miR载体后将第一个CCL3L1片段插入pcDNA6.2-GW/miR载体命名为pcDNA6.2-CCL3L1-1。由于载体本身在BglII位点后带有XhoI酶切位点利用BamHI和XhoI切割pcDNA6.2-CCL3L1-1回收CCL3L1片段,BglII和XhoI切割pcDNA6.2-CCL3L1-1回收大片段做载体重组形成含有两个连续CCL3L1片段的质粒命名为pcDNA6.2-CCL3L1-2,重复此步骤可得到含有N个CCL3L1基因串联体的重组质粒pcDNA6.2-CCL3L1-X。结果:经酶切和测序证实成功构建含有4个CCL3L1基因串联体的重组质粒pcDNA6.2-CCL3L1-4,并同时产生含有1个和2个CCL3L1基因串联体的重组质粒。结论:利用同尾酶技术可以快速有效地构建CCL3L1基因串联重组质粒,实现目的片段的无限扩大,为小片段基因表达的研究奠定基础。     

鹅源新城疫病毒ZJI株基因组cDNA克隆的序列修饰*

将鹅源新城疫病毒ZJI株全基因组cDNA克隆通过酶切切下包含T7启动子区域和转录载体的片段,将其自身环化后获得约6.5kb的质粒。设计引物,利用基因定点突变技术,在此质粒上T7启动子与NDV Leader序列之间突变插入额外的3个G碱基,将此突变最终引入到原基因组cDNA克隆中。应用RT-PCR技术从尿囊液中扩增NDV基因组F/HN基因区域部分片段,利用限制性内切酶BsmB I将扩增片段连接,最终将原cDNA克隆中相应片段替换下。测序结果表明,原基因组cDNA克隆中特定位置碱基     

禽腺病毒QU株一个复制非必需区的鉴定

禽腺病毒QU弱毒株属于鸭腺病毒1型病毒, 可作为潜在的重组疫苗载体。为确定QU株的复制非必需区, 参照鸭腺病毒1型病毒基因组右侧E4区附近序列设计引物, 扩增QU株基因组的一段3.4 kb片段, 插入来自pEGFP-C1质粒的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒片段, 构建了含EGFP基因的重组质粒pADGFP。采用脂质体介导法, 将重组质粒pADGFP与QU株共转染CEF细胞, 用96孔板稀释法筛选纯化表达绿色荧光蛋白的重组QU病毒株rQUGFP。该重组毒的生长曲线与亲本毒一致, 连续传代后病毒滴度稳定。结果表明, QU株基因组右侧E4区附近一段包括ORF1、ORF8和ORF9三个开放阅读框的区域为病毒的复制非必需区, 且插入的EGFP基因可以稳定表达。为进一步以禽腺病毒QU株为载体构建重组疫苗的研究打下基础。     

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。     

通路克隆入门载体pEN-L4~*-PrbcS-~*T-gfp-L3~*的构建及其应用

为了利用通路克隆(Gateway)技术构建一个含有两个目的基因表达盒的植物表达载体,并把目的基因编码的蛋白质定位到转基因植物的叶绿体中,通过定点突变技术,在含有attL4和attL3重组位点的Gateway入门载体pEN-L4-2-L3中产生HindⅢ和XhoⅠ的酶切位点,然后在这两个酶切位点之间插入一个含有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的光诱导型启动子(PrbcS)及其叶绿体基质定位序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因(gfp)的DNA片段,获得pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体.用该载体和另一个含有attL1和attL2重组位点的入门载体(pENTR*-PrbcS-*T-gus)与Gateway的目的载体pK7 m34GW2-8 m21GW3进行LR重组反应可以构建一个能串联gfp和gus两个报告基因表达盒的植物表达载体pKm-35S-PrbcS-*T-gfp-PROLD-PrbcS-*T-gus,所构建的植物表达载体转化烟草后,gfp和gus基因能插入到转基因烟草的基因组中并正常表达,所表达的GFP蛋白可正确定位到转基因植物的叶绿体中,而GUS蛋白也可以在叶片中表达.利用此表达载体通过一次转化事件不仅可以完成两个目的基因的转化操作,而且还可以利用叶绿体基质定位序列(*T)把PrbcS控制表达的目的蛋白直接定位到转基因植物的叶绿体中.因此pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体的应用进一步扩大了Gateway技术及植物表达载体的应用范围,为叶绿体基因工程操作提供了一个更方便的技术平台.     

Identification and characterization of two critical sequences in SV40PolyA that activate the green fluorescent protein reporter gene

Alu repeats or Line-1-ORF2 (ORF2) inhibit expression of the green fluorescent protein (GFP) gene when inserted downstream of this gene in the vector pEGFP-C1. In this work, we studied cis-acting elements that eliminated the repression of GFP gene expression induced by Alu and ORF2 and sequence characteristics of these elements. We found that sense and antisense PolyA of simian virus 40 (SV40PolyA, 240 bp) eliminated the repression of GFP gene expression when inserted between the GFP gene and the Alu (283 bp) repeats or ORF2 (3825 bp) in pAlu14 (14 tandem Alu repeats were inserted downstream of the GFP gene in the vector pEGFP-C1) or pORF2. Antisense SV40PolyA (PolyAas) induced stronger gene expression than its sense orientation (PolyA). Of four 60-bp segments of PolyAas (1F1R, 2F2R, 3F3R and 4F4R) inserted independently into pAlu14, only two (2F2R and 3F3R) eliminated the inhibition of GFP gene expression induced by Alu repeats. Deletion analysis revealed that a 17 nucleotide AT repeat (17ntAT; 5'-AAAAAAATGCTTTATTT-3') in 2F2R and the fragment 3F38d9 (5'-ATAAACAAGTTAACAACA ACAATTGCATT-3') in 3F3R were critical sequences for activating the GFP gene. Sequence and structural analyses showed that 17ntAT and 3F38d9 included imperfect palindromes and may form a variety of unstable stem-loops. We suggest that the presence of imperfect palindromes and unstable stem-loops in DNA enhancer elements plays an important role in GFP gene activation.     

Impact of copy number of distinct SV40PolyA segments on expression of a GFP reporter gene

The presence of Alu repeats downregulates the expression of the green fluorescent protein(GFP) gene.We found that SV40PolyA(PolyA,240 bp),in either orientation,eliminated the inhibition of GFP gene expression induced by Alu repeats when it was placed between the GFP gene and the Alu repeats.In this study,4 different segments(each 60 bp) were amplified from antisense PolyA(PolyAas) by PCR,and inserted upstream of Alu14 in pAlu14 plasmid(14 Alu repeats inserted downstream of the GFP gene in vector pEGFP-C1 in...     

Effect of mutations in a simian virus 40 PolyA signal enhancer on green fluorescent protein reporter gene expression

Our previous studies have shown that tandem Alu repeats inhibit green fluorescent protein (GFP) gene expression when inserted downstream of the GFP gene in the pEGFP-C1 vector. We found that the 22R sequence (5'-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT-3') from the antisense PolyA (240 bp polyadenylation signal) of simian virus 40, eliminated repression of GFP gene expression when inserted between the GFP gene and the Alu repeats. The 22R sequence contains an imperfect palindrome; based on RNA structure software prediction, it forms an unstable stem-loop structure, including a loop, a first stem, a bulge, and a second stem. Analysis of mutations of the loop length of the 22R sequence showed that the three-nucleotide loop (wild-type, 22R) induced much stronger GFP expression than did other loop lengths. Two mutations, 4TMI (A7→T, A17→T) and 5AMI (A6→T, T18→A), which caused the base type changes in the bulge and in the second stem in the 22R sequence, induced stronger GFP gene expression than 22R itself. Mutation of the bulge base (A17→T), leading to complete complementation of the stem, caused weaker GFP gene expression. Sequences without a palindrome (7pieA, 5'-GTGAAAAAAATG CAAAAAAAGT-3', 7pieT, 5'-GTGTTTTTTTTGCTTTTTTTGT-3') did not activate GFP gene expression. We conclude that an imperfect palindrome affects and can increase GFP gene expression.