云南野生稻资源及其保护

云南野生稻生态类型丰富,且具有抗白叶枯病、抗稻瘟病、耐旱、耐寒等栽培稻不具有或已经消失的遗传基因,是水稻品种改良的优良基因库。然而,随着人类社会经济活动对生态环境影响的加剧,这一宝贵的战略性生物资源正面临着快速消失的危险。为了加强云南野生稻资源的保护,近年来,我们对云南野生稻资源开展了原生境保护(物理隔离方式和主流化方式)及非原生境保护(种质库、种质圃、细胞库和DNA库)等保护技术研究,明确了各种保护方法的优缺点和适用性,保护了云南野生稻的多样性和丰富度,为改良栽培稻储备了丰富的基因源。     

通路克隆入门载体pEN-L4~*-PrbcS-~*T-gfp-L3~*的构建及其应用

为了利用通路克隆(Gateway)技术构建一个含有两个目的基因表达盒的植物表达载体,并把目的基因编码的蛋白质定位到转基因植物的叶绿体中,通过定点突变技术,在含有attL4和attL3重组位点的Gateway入门载体pEN-L4-2-L3中产生HindⅢ和XhoⅠ的酶切位点,然后在这两个酶切位点之间插入一个含有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的光诱导型启动子(PrbcS)及其叶绿体基质定位序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因(gfp)的DNA片段,获得pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体.用该载体和另一个含有attL1和attL2重组位点的入门载体(pENTR*-PrbcS-*T-gus)与Gateway的目的载体pK7 m34GW2-8 m21GW3进行LR重组反应可以构建一个能串联gfp和gus两个报告基因表达盒的植物表达载体pKm-35S-PrbcS-*T-gfp-PROLD-PrbcS-*T-gus,所构建的植物表达载体转化烟草后,gfp和gus基因能插入到转基因烟草的基因组中并正常表达,所表达的GFP蛋白可正确定位到转基因植物的叶绿体中,而GUS蛋白也可以在叶片中表达.利用此表达载体通过一次转化事件不仅可以完成两个目的基因的转化操作,而且还可以利用叶绿体基质定位序列(*T)把PrbcS控制表达的目的蛋白直接定位到转基因植物的叶绿体中.因此pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体的应用进一步扩大了Gateway技术及植物表达载体的应用范围,为叶绿体基因工程操作提供了一个更方便的技术平台.     

基于CRISPR/Cas9的精准基因编辑技术研究进展

基因编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。基于CRISPR/Cas9系统的精准编辑技术是一个操作方便、应用广泛的基因编辑技术,与传统的CRISPR/Cas9不同,精准基因编辑技术可以在不需要DNA模板的情况下对基因进行定点突变。本文重点介绍了近年来基于CRISPR/Cas9介导的精准基因编辑技术的发展,并深入分析了基因精准编辑技术面临的挑战和机遇。     

转DAS/DAK基因天竺葵甲醛代谢途径与吸收能力研究

以天竺葵(Pelargoniumsp.Frensham)为材料,通过在天竺葵的叶绿体中过量表达来自甲基营养型酵母同化甲醛(HCHO)途径的关键基因二羟基丙酮激酶基因(DAS)和二羟基丙酮合酶基因(DAK),获得具有DAS/DAK HCHO同化途径的转基因天竺葵,利用13 C-NMR技术对液体H13 CHO胁迫下野生型和转基因天竺葵H13 CHO代谢产物进行了比较分析,并测定了气体HCHO胁迫下野生型和转基因天竺葵的生理生化指标。结果显示:(1)2mmol·L-1液体H13 CHO胁迫下,过表达DAS/DAK基因增强了卡尔文循环在转基因天竺葵H13 CHO代谢中的作用,使糖类物质生成量增加约2.85倍,同时改变了天竺葵中原有HCHO代谢途径。(2)48μg·L-1的气体HCHO胁迫下,转基因天竺葵叶片中H2O2、丙二醛和蛋白羧基的含量显著小于野生型。(3)在环境污染气体HCHO的胁迫下,转基因天竺葵叶片的HCHO吸收效率和气孔传导率显著高于野生型。研究表明,过表达DAS/DAK基因能够有效地提高天竺葵净化环境中污染气体HCHO的能力。     

常春藤代谢气体甲醛中间产物及甲醛胁迫下叶片相关生理特性变化分析

很多研究发现常春藤(H.helix)能吸收甲醛(HCHO),对常春藤气体HCHO吸收能力分析表明常春藤能有效清除空气中污染的气体甲醛.13CNMR分析发现用高浓度气体H13CHO处理常春藤,在叶片中出现的主要代谢中间产物为13CH3OH、[[5-13C]Met、U-13C]Gluc、[U-13C]Fruc、[3-13C]Ser、[2-13C]Gly、[5-13C]Arg、[3-13C]Ala、[4-13C]malate、[3-13C]malate及少量的[2-13C]Ser和H13COOH.此外,在气体H13CHO处理短时间的叶片抽提物中有游离H13CHO和甲醛加合物H13CHO-Gln,证实H13CHO确实被吸收到叶片细胞中,随着处理时间的增加这两个峰消失,说明通过自身的代谢作用H13CHO被有效清除.在气体甲醛胁迫下,常春藤叶片丙二醛、过氧化氢和羰基化蛋白质的含量升高,说明甲醛胁迫在常春藤叶片里诱发了氧化损伤,从而使叶片气孔传导率下降,甲醛吸收速率和效率减小.     

叶面喷施甲醇和乙醇对万年青生理特性的影响

为了比较甲醇和乙醇对植物生理特性的影响,分别用5％(V/V)的甲醇和乙醇均匀喷洒于温室条件下盆栽培养的万年青叶片上,以喷施蒸馏水的植物为对照,每周喷施2次,喷施3周后分析这两种醇对万年青叶片生长、生理特性及相关光合基因表达的影响.结果表明,喷施甲醇和乙醇均增加了万年青叶片鲜重、可溶性总蛋白质含量、气孔导度、蒸腾速率、胞间CO2浓度、净光合速率、叶绿素a、b及总叶绿素的含量,降低了过氧化氢的含量,提高了质膜H+ ATPase及H+泵活性,并且乙醇的作用效果比甲醇更加明显.RT-PCR分析结果表明,光合作用相关基因叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab)和铁氧还蛋白-2编码的基因(2-FdO)在处理12h时被甲醇抑制但却被乙醇诱导,72 h时被甲醇诱导但却被乙醇抑制;两种醇均诱导光系统Ⅱ反应中心PsbP家族蛋白编码基因(PsbP)的表达.由此推测甲醇和乙醇可能在植物中作为信号分子起作用,且乙醇的刺激效果比甲醇更加显著.     

用于通路(Gateway)克隆技术的植物表达载体研究进展

通路(Gateway)克隆技术是根据λ噬菌体基因组和大肠杆菌基因组之间的位点专一性重组分子机制开发的一套分子克隆新技术.利用该技术LR反应构建目的基因的表达载体时不需要经过酶切和连接等繁琐而又费时的过程,因此,可以节省很多时间.为了扩大Gateway技术在植物基因工程领域的应用,最近有很多研究机构和研究小组开发了能用于组成型或诱导型表达目的基因、基因沉默、启动子分析、蛋白质亚细胞定位、蛋白质/蛋白质相互作用、多个DNA片段的模块化组装和DNA组片段功能验证等研究用的植物表达载体.该文对这些技术的研究进展进行了综述.     

药用野生稻拮抗稻瘟病内生细菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

【背景】稻瘟病是水稻的三大重要病害之一，每年对水稻生产都会造成较大的损失，生物防治稻瘟病已成防治该病害的重要手段，而目前鲜少有报道从药用野生稻中分离内生菌用以防治稻瘟病。【目的】从药用野生稻内生菌中挖掘对稻瘟病具有拮抗作用的微生物资源。【方法】采用分离法从勐遮药用野生稻中先分离出内生菌，再通过平板对峙法筛选对稻瘟病菌具有拮抗作用的菌株，通过形态学和16S rRNA基因序列分析对菌株进行鉴定，同时筛选该菌株的最适培养基、pH、培养温度和摇床转速。【结果】筛选得到拮抗菌株Z5，在LB培养基上对稻瘟病菌菌丝生长的抑制率达到96.43%，经形态学和16S rRNA基因序列分析，初步鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。在NYBD、CM、LB、NA和YSP这5种培养基中，菌株Z5的最适培养基为NYBD培养基、最适pH值为8.0-9.0、最适培养温度为35℃、最适摇床转速为250 r/min。【结论】短小芽孢杆菌Z5对稻瘟病菌的生长具有较好的抑制作用，且该菌株耐高温、较耐酸碱，作为稻瘟病生防制剂研发具有一定的价值。