GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7-ACA)酰化酶 (3.1.5.11)可有效催化GL-7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成7-氨基头孢烷酸 (7-ACA)而成为两步酶法生产7-ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL-7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR204pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7.5～ 8.5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g/L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g/L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4.0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率,即比酶活看,pH反馈的补料方法略高于恒速或指数流加模式。     

克鲁维酵母Y-85合成菊粉酶最适条件的研究

采用响应面方法（ResponseSurfaceMethod,RSM）对克鲁维酵母（Kluyveromycessp．）Y－85产菊粉酶培养基成份进行了优选,和正交试验相比,该法选出的最适培养基的酶发酵水平提高28％。用15L自控发酵罐进行产酶条件控制试验,并在1000L罐上进行5批次酶发酵中试,平均菊粉酶活性达68.9u／ml。     

嗜碱芽孢杆菌XE22-4-1碱性弹性蛋白酶发酵条件的研究

从西藏天然碱湖中筛选到一株产碱性弹性蛋白酶 (alkalineelastase)菌株 ,最适生长pH为 1 0 0 ,经鉴定为Bacillussp .,编号XE2 2 4 1。该菌产酶最适碳源为 2 %葡萄糖 ,氮源为0 2 5%酵母粉 ,豆饼粉对发酵产酶有促进作用。 2L发酵罐实验表明 ,溶解氧是影响该菌株产酶的重要因素。通过提高通气量和改变搅拌速度 ,该菌株可在发酵 48h内达到产酶高峰 ,酶活力最高达 2 66u mL     

在生香毛霉酶促磷酸化体系中葡萄糖的醇解和嘌呤核苷酸代谢的调节

我们研究了生香毛霉(M·aromaticus Povah)酶促磷酸化体系中糖的酵解特性和葡萄糖、磷酸盐对嘌呤核苷酸代谢的调节作用。试验表明,生香毛霉具有较强的糖酵解酶系活力和发酵力。但是它的发酵能力易受菌体保存温度和放置时间的影响。     

利用degQ基因提高枯草芽孢杆菌纤溶酶表达*

从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中通过PCR扩增得到degQ基因,将其克隆到含有枯草杆菌纤溶酶基因的蔗糖诱导表达载体pUBS中,并转化至B.subtillisDB403受体菌,得到基因工程菌DB403(pUBSD)。通过发酵表达证实degQ基因能增强枯草杆菌纤溶酶的表达,酶活提高了2.2倍。同时还对不同种类的糖、不同浓度蔗糖、不同诱导时间等发酵条件进行优化和比较研究。     

卡拉胶固定粘质赛氏菌产碱性蛋白酶的研究

将粘质赛氏菌(Seratia marcescens)包埋于卡拉胶中,发现2．5％的卡拉胶适于固定该菌产碱性蛋白酶。固定化细胞在其较适宜产酶培养基中发酵,酶活力一般可达400u/ml,在卡拉胶中添加3％玉米粉和1%豆饼粉或2％砂子制备固定化细胞,其产酶能力分别提高了25%和23．9％;固定化细胞颗粒越小,其产酶能力越高。采用摇瓶半连续发酵。其产酶半衰期为14次(24小时为一个周期);而用环流器进行半连续发酵,其产酶半衰期为52次(12小时为一个周期),产酶效率分别比游离细胞摇瓶发酵的产酶效率高11．8％和45．07％,而环流器半连续发酵的产酶效率比摇瓶半连续发酵高29．7％。     

爱德华氏菌产乳酸氧化酶的条件研究

在以前工作的基础上,对已获得的产乳酸氧化酶的5株菌进行复筛,对产酶量大的一株菌进行了分类鉴定,确定该菌株属迟钝爱德华氏菌生物群I(Edwardsiella tarda Biogroup I)。这与曾报道的产乳酸氧化酶分枝杆菌(Mycobacterium)和片球菌(Pediococcus)是不同的菌。分别研究了培养基中的培养初始pH、核黄素、乳酸钠以及硫酸铵对发酵产乳酸氧化酶的影响。这一酶源在酶法生产丙酮酸及医疗诊断和酶电极应用上有意义。     

青霉素G酰化酶调节基因的定位

为了定位青霉素G酰化酶的调节基因,从质粒Ppa6克隆了一系列青霉索G酰化酶基因(pac)的片段,将这些重组质粒转化E.coli D816,测定克隆片段对pac表达的影响。如果克隆片段含有完整的调节基因(pacR)。诱导剂不能使由高拷贝pacR表达的阻抑物失活,部分阻抑物结合pac操纵基困,阻碍RNA聚合酶对加pac的转录,因此pac的表达量降低。发酵结果表明,阻抑物可能是由pac结构基因内部的ORFⅡ编码的蛋白因子。     

嗜热毛壳菌内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

探讨了液体发酵嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)产生的内切β葡聚糖酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE\|Sepharose Fast Flow阴离子层析、Pheny1\|Sepharose疏水层析、Sephacry1 S\|100分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的内切β\|葡聚糖酶。经125%SDS\|PAGE和凝胶过滤层析法分别测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为67.8kD和69.8kD。该酶反应的最适温度和pH分别为60℃和40～45在pH50条件下,该酶在60℃下稳定;70℃保温1h后,仍保留30%的活性;在80℃的半衰期为25min。金属离子对内切β\|葡聚糖酶的活性影响较大,其中Na+对酶有激活作用;Fe2+、Ag+、Cu2+、Ba2+、Zn2+等对酶有抑制作用。该酶对结晶纤维素没有水解能力。     

纳豆激酶产生菌——纳豆菌对木糖和葡萄糖的利用

在纳豆激酶 (Nattokinase,简称NK)发酵条件研究中 ,我们发现木糖是较葡萄糖更佳的产酶碳源。进一步的试验证明 ,NK的发酵菌种———Bacillussubtilisvar.natto在混合碳源中没有二次生长现象 ,对木糖和葡萄糖的吸收是同时的 ,且互不干扰 ,葡萄糖对木糖的吸收利用没有分解代谢阻遏。     

利用强启动功能片段提高麦迪霉素4”，-羟基丙酰化酶基因的表达

用PCR技术将本室克隆到的强启动功能片段取代麦迪霉素丙酰化酶基因(mpt)的启动子或与mpt基因自身启动子串连,获得含mpt重组质粒pCHFPE3和pCHFPE2。用含有这两个质粒的Streptomyces lividans TK24对螺旋霉素进行微生物转化,结果表明,与含有原启动子的mpt．S．Lividans TK24(p．WFPE)相比,丙酰螺旋霉素的组分比例分别提高了89．02％和58．53％。含重组质粒pCHFPE2的螺旋霉素产生菌S．Spiramyceticus发酵产物中丙酰螺旋霉素的组分也有较大辐度的提高。说明利用该强启动功能片段可以提高麦迪霉素丙酰化酶基因的表达。     

灰色链霉菌RX-17溶菌酶R1的纯化及性质研究

通过硫酸铵分级沉淀,CM-Sephadex C50、CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析及Sephadex G-75凝胶过滤层析,从灰色链霉菌（Streptomyces griseus）RX17的发酵上清液中得到了电泳纯的溶菌酶R1,回收率6.89%。测得该酶分子量和等电点分别为16.8kD和9.10,作用于变链球菌（Streptococcus mutans）Ingbritt的最适温度和pH分别为70℃和6.6。R1酶在50℃以下及pH6～9的范围内保持稳定,60℃保温1h,残存酶活20.3％。Mg2+对酶有激活作用,而Zn2+、Cu2+、Fe2+、Cd2+、Pb2+则使酶完全丧失活性,螯合剂、盐酸羟胺、碘乙酸抑制酶活,β-巯基乙醇及表面活性剂则对溶菌有部分促进作用。R1酶溶菌谱广泛,对多种卵清溶菌酶不能作用的G+、G细菌均有溶解能力,对变链球菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、乳杆菌(Lactobacillus)等则呈现高活性。     

菊糖酶发酵生产条件的研究

脆壁克鲁维氏酵母（Kluyveromycesfragilis）在pH5．5的适当培养基中,28℃摇瓶培养30h后,进行分批发酵。结果表明：发酵初始pH为6．0～6．5,菊糖浓度为2％,接种量4％,控制前期发酵温度为28℃,33h后发酵温度为32～34℃。发酵周期为70h左右,最高产酶达240u／ml。在5L自控发酵罐中,产酶达到同样水平,发酵周期缩短约10h。     

酿酒酵母gpd1和hor2基因在大肠杆菌中的共表达

利用途径工程的方法,在大肠杆菌中构建一条新的产甘油的代谢途径。从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)克隆3_磷酸甘油脱氢酶基因(gpd1)和3_磷酸甘油酯酶基因(hor2 ) ,并将两个基因串连到启动子trc的下游,构建由trc启动子控制的能高效表达的多顺反子重组质粒pSE_gpd1_hor2 ,将重组质粒导入大肠杆菌BL2 1菌株中,构建得到的重组菌株GxB_gh能将葡萄糖转化为甘油。结果表明重组菌株GxB_gh以葡萄糖为底物进行发酵,甘油产量为4 6 6 7g L ,葡萄糖的转化率为4 2 87%。这为利用工程菌绿色生产甘油进行了前期的探索,也为进一步构建能生产1,3_丙二醇的工程菌打下了良好的基础。     

乳糖发酵短杆菌色氨酸营养缺陷株的诱变*

用亚硝基胍(NTG)诱变乳糖发酵短杆菌(Breevibacterium lactofermentum)ATCC-13869得到34株氨基酸营养缺陷突变株。经添加生物合成代谢途径中的不同底物鉴定,突变株33为色氨酸酶基因(tnA)缺陷,突变株34为色氨酸合成酶基因(trpB trpA)缺陷。     

D-泛解酸内酯水解酶产生菌的筛选及产酶条件研究

筛选到一株产D 泛解酸内酯水解酶的菌株 ,经鉴定为串珠镶孢霉菌 (Fusariummonili forme)SW 90 2。产酶条件研究表明 ,用甘油作碳源 ,蛋白胨作氮源 ,初始pH8 0 ,温度 2 6℃ ,摇瓶培养 3d ,产酶量最高。在 6 0L发酵罐中通风发酵 45h ,产菌丝体生物量 7 1 8g干菌体 L ,D 泛解酸内酯水解酶酶活力达到 0 92IU g干菌体     

浑球红假单胞菌在暗处发酵生长时的固氮酶、吸氢酶以及放氢机制的研究

光合细菌浑球红假单胞菌(Rhodopesudomonas sphaeroides)能在黑暗厌氧条件下生长。首次发现发酵生长的浑球红假单胞菌有固氮酶和吸氧酶的活性。试验比较了在光营养、黑暗厌氧呼吸和好氧呼吸生长方式下该菌的放氢作用,认为黑暗厌氧呼吸过程中的放氢是氢酶催化的放氢。     

数学统计法快速优化假单胞菌脂肪酶发酵条件

应用快速有效的数学统计方法对Pseudomonassp．H18的脂肪酸发酵条件进行了优化。采用Plackett－Burman设计对影响产酶的重要因素进行了筛选,然后利用响应面分析（RSA）法对这些产酶重要影响因素进行了优化,各因素的最佳水平通过Box的complexalgorithm法得以确定。     

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

纤维素酶在木质纤维素生物质转化中的应用研究

选育得到纤维素酶高产菌株里氏木霉突变菌株(Trichoderma reesei) 813A,优化了其发酵产酶条件。利用该菌株所产纤维素酶对天然木质纤维素的水解糖化过程进行研究,确定了实验条件下最优的糖化条件(温度50℃, pH 4.5,酶浓度6～8 FPU/mL,底物浓度2%)。以玉米叶和杨树叶为天然纤维素原料,水解糖化率分别达到86.2％和56.0%。通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)将糖化液转化为酒精,产乙醇浓度达到 5%～5.8%,转化率为79.4%～92.1%。