耐放射异常球菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

利用生物信息学手段,在GenBank中进行氨基酸序列的同源性比较分析,检索到来自于耐放射异常球菌（Deinococcus radiodurans）基因组序列中一功能未确定的开放阅读框（ORF）,其氨基酸序列和已报道的海藻糖合成酶的氨基酸序列有约60％的同源性.将这段ORF克隆到大肠杆菌进行表达,并进行功能鉴定.实验表明这段ORF序列所编码的是一种海藻糖合成酶,它能将麦芽糖分子转化成海藻糖分子,以30％的麦芽糖为底物时能将约65％的麦芽糖转化成海藻糖.重组酶性质初步研究表明,在pH 7.0,最佳温度30℃转化麦芽糖效率最高.     

弗氏柠檬酸菌dhaT基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究

1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PD）是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR) 的基因dhaT,序列显示与来源于C.freundii DSM 30040 (Genbank U09771)相应基因的相似性为78%。将此基因构建于表达载体pSE380,得到重组质粒pSE-dhaT。重组质粒转化到宿主菌E.coli JM109中进行了表达,重组酶通过镍柱及Sephacral S-300进行纯化,重组酶SDS-PAGE结果显示有非常明显的单一的42kDa特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适pH为8.0,对丙醛的Km值为10.05mmol/L,最大反应速度Vmax为37.27umol/ min /mg;以1,3-PD为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适pH为10.5,对1,3-PD的Km值为1.28mmol/L,最大反应速度Vmax为25.55umol/min/mg。重组酶的还原反应比活为49.50U/mg,氧化反应比活为79.72U/mg。该酶同样具有假定的结合Fe2+的G-X-X-H-X-X-A-H-X-X-G-X-X-X-X-X-P-H-G模体保守结构。此研究为工程菌高效生产1,3-PD奠定了基础。     

谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

利用生物信息学手段,在GenBank数据库进行氨基酸的同源性检索分析,发现来自谷氨酸棒杆茵(Corynebacterium glutamicum)一功能未确定的ORF序列被注释为假设的海藻糖酶(putative trehalose sesynthase),它与已报道的海藻糖合成酶的氨基酸序列有60％以上的同源性。本研究把这段ORF克隆到大肠杆茵进行表达及进行功能鉴定。实验表明这段ORF序列为一新的海藻糖合成酶基因,其表达产物能将麦芽糖分子转化成海藻糖分子。重组酶性质的初步研究表明重组酶在pH7．0～7．5,30℃转化麦芽糖效率最高。     

产1,3-丙二醇基因工程菌发酵条件的研究

利用途径工程的方法,将来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶基因dhaB和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT构建成多顺反子重组质粒pSE-dhaB-dhaT并在大肠杆菌JM 109中进行表达,在大肠杆菌中构建一条新的产1,3-丙二醇代谢途径。研究表明,重组菌株JM 109/pSE-dhaB-dhaT在微好氧条件下,尝试用廉价的乳糖为诱导物、维生素B12为辅酶,可以将甘油转化为1,3-丙二醇,产量达15.34 g/L,甘油转化率为35.7%,对低成本生产1,3-丙二醇作了有益的探索。     

酿酒酵母gpd1和hor2基因在大肠杆菌中的共表达

利用途径工程的方法,在大肠杆菌中构建一条新的产甘油的代谢途径。从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)克隆3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpd1)和3-磷酸甘油酯酶基因(hor2),并将两个基因串连到启动子trc的下游,构建由trc启动子控制的能高效表达的多顺反子重组质粒pSE-gpd1-hor2,将重组质粒导入大肠杆菌BL21菌株中,构建得到的重组菌株GxB-gh能将葡萄糖转化为甘油。结果表明重组菌株GxB-gh以葡萄糖为底物进行发酵,甘油产量为46．67g／L,葡萄糖的转化率为42.87％。这为利用工程菌绿色生产甘油进行了前期的探索,也为进一步构建能生产1,3-丙二醇的工程菌打下了良好的基础。     

弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶激活因子基因的克隆、表达与功能鉴定

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,其生物法生产的研究逐渐受到的关注。研究以弗氏柠檬酸菌的总DNA为模板,通过PCR分别扩增出约1.8kb（dhaF）和0.4kb（dhaG）的两个基因片段分别编码甘油脱水酶激活因子大、小亚基, 连接于pMD-18T载体,测序分析显示与GenBank中相关基因的相似性最高为86%。将两基因以多顺反子的方式与pSE380连接构建表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达,表达量占总蛋白的30%。将高效表达的激活因子用金属亲合层析和分子筛进行了纯化,得到电泳纯级的甘油脱水酶激活因子,SDS-PAGE分析显示：大、小亚基分子量约为63kDa和12kDa;非变性胶分析显示：全酶的分子量约为150kDa,经扫描分析推测甘油脱水酶激活因子很有可能是以α2β2方式结合的。以弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶为研究对象,进行激活实验,结果证实该激活因子具备甘油脱水酶激活因子的功能,为进一步阐明甘油脱水酶的激活机制及1,3-丙二醇的高效生产奠定了基础。