尿素对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种形成微体的影响

对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种NP_(co)N22的超显微形态、结构和长链二元酸合成的关系进行了研究。烷烃能诱导热带假丝酵母微体(microbody)的形成。在适量尿素(0.1％)存在下的烷烃发酵能合成大量长链二元酸,同时菌体内有很多微体出现,但在过量尿素(0.2％)存在下,则长链二元酸的合成和微体的形成均受抑制,说明微体的存在是长链二元酸合成的必要条件。由于微体对烷烃的利用和长链二元酸的合成有关,ω氧化酶系也可能定位于微体上。 在过量尿素(0.2％)存在下,微体的形成和长链二元酸的合成都被抑制,尿酸氧化酶也明显降低,但过氧化氢酶和D-氨基酸氧化酶都比适量尿素(0.1％)培养的菌体显著增加。这些结果指出,微体的出现和这三种所谓微体的“标志酶”的活力是不平行的。因此“标志酶”的提法值得商榷。     

热带假丝酵母(Candida tropicalis)79微体蛋白质组分的分析研究

纯化的微体,经过渗透休克、反复洗涤,被分成微体膜和可溶性组分两部分。它们的蛋白质含量分别占微体蛋白质总量的70%和30%左右。酶学分析表明,过氧化氢酶和尿酸氧化酶主要分布在微体可溶性部分,NADH-细胞色素c还原酶(抗霉素不敏感型)可能是与微体膜相连结的蛋白质。用淀粉凝胶分离、普鲁士蓝染色的方法,在微体可溶性部分检出两种不同类型的过氧化氢酶。经SDS-PAGE分析,微体膜显示出25条蛋白亚基带,可溶性部分显示出21条蛋白亚基带。微体蛋白亚基分子量范围在14K～140K之间。其中,33K蛋白亚基是微体膜的主要结构蛋白;24K、26K和33K蛋白亚基为糖蛋白;63K和36K蛋白亚基分别是过氧化氢酶和尿酸氧化酶。在双相凝胶电泳图谱上,微体膜出现110个斑点,可溶性部分出现59个斑点。过氧化氢酶和尿酸氧化酶在双相凝胶电泳图谱中的位置都已确定。采用交叉免疫电泳的方法,研究了微体蛋白质在酵母生长过程中的变化。结果表明:热带假丝酵母79培养18小时,微体发育成熟;36小时后,微体开始降解。     

热带假丝酵母酰基辅酶A氧化酶的活性测定方法*

酰基辅酶A氧化酶 (ACO)是热带假丝酵母内二元酸β氧化的限速酶。工业上利用烷烃生产二元酸时 ,使用ACO低活性的菌株 ,将有利于提高二元酸的产量和纯度。本文以热带假丝酵母为材料 ,在Allain方法基础上加以改进 ,可简便、准确地测定ACO酶活性 ,为二元酸生产菌株的筛选方法提供了量化标准 ,并为进一步研究此酶的酶学性质奠定了基础。对本实验室所保存的一系列具有不同产酸能力的热带假丝酵母菌种进行酶活性测定 ,发现酶活性与产酸能力有明显的相关性。     

热带假丝酵母代谢烷烃过程中的β-氧化和代谢调控

热带假丝酵母 (Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ)能利用烷烃作唯一碳源和能源。当以烷烃或脂肪酸为碳源时 ,在细胞内可形成大量的过氧化物酶体 (ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ) ,同时诱导生成脂肪酸 β 氧化酶系 ,当以葡萄糖为碳源时 ,则极少有过氧化物酶体形成[1] ,一些Ｃ .ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ能氧化烷烃生成长链二元酸 (ｌｏｎｇｃｈａｉｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ ,ＤＣＡ)。由于这些特征 ,人们从酶学、分子生物学和实际应用等方面对这种酵母进行了深入研究 ,并阐述了Ｃ .ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ代谢烷烃的途径、脂肪酸β 氧化酶系…     

热带假丝酵母产生子囊孢子的条件及单倍体分离的研究

本文研究了诱导热带假丝酵母子囊孢子产生和子囊破壁的条件,以及单倍体分离和鉴别方法.结果表明:NaAc、KCl这两种成分即可满足热带假丝酵母的产孢营养要求,在含有NaAc 8.2 g/L、KCl 1.8 g/L的琼脂培养基中,28℃培养7 d,热带假丝酵母细胞的产孢率可达到47.5%;单纯使用蜗牛酶对破除热带假丝酵母子囊壁的效率甚低,酶解液加入适量的石英砂同时振荡处理4 h左右,可以显著提高对热带假丝酵母子囊破壁速率.用这种方法处理,绝大多数子囊壁均可破除.子囊破壁处理后再以52℃处理10 min杀死残余的营养体细胞,分离物的单倍体孢子比例可由灭活处理前的48%,提高到76%以上.     

新的热带假丝酵母载体-宿主系统的建立

热带假丝酵母(Candida tropicalis)是一种可以利用多种非糖碳源代谢的微生物,在石油发酵、石油化工生产领域已得到长期应用^[1]。随着分子生物学研究技术的发展。通过代谢工程技术改变热带假丝酵母的代谢途径和流向．发展出能够把石油中的烃类物质发酵转化成各种重要化工原料、中间体的新型生产菌株,已普遍受到国内外研究机构的重视。另一方面,热带假丝酵母具有细胞生长密度高,分泌蛋白能力强等特点,可以发展成一个重要的异源蛋白表达体系。建立稳定高效的热带假丝酵母载体一宿主系统是实现上述构想的前提和关键。迄今为止,在热带假丝酵母细胞内尚未发现能游离于染色体外自主复制的天然质粒存在。目前已有20余种热带假丝酵母基因被克隆和鉴定。大部分与热带假丝酵母的氧化代谢过程有关,其中5个过氧物酶体蛋白基因的结构和2个细胞色素P450系统基因的表达调控规律巳被阐明^[2-5],与DNA复制过程有关的基因或功能序列均未见报道。本文研究和探索Candida属其他微生物基因元件在热带假酵母中的功能作用,选用热带假丝酵母细胞色素P450单加氧酶基因的启动子和侧翼调控序列^[3],构建了一套新的热带假丝酵母载体一宿主系统,并成功地表达了小鼠CYPlAl基因。     

热带假丝酵母酰基辅酶A氧化酶的活性测定方法

酰基辅酶A氧化酶（ACO）是热带假丝酵母内二元酸β氧化的限速酶,工业上利用烷烃生产二元酸时,使用ACO低活性的菌株,将有利地提高二元酸的产量和纯度,本以热带假丝酵母为材料,在Allain方法基础上加以改进,可简便,准确地测定ACO酶活性,为二元酸生产菌株的筛选方法提供了量化标准,并为进一步研究此酶的酶学性质奠定了基础,对本实验室所保存的一系列具有不同产酸能力的热带假丝酵母菌种进行酶活性测定,发现酶活性与产酸能力有明显的相关性。     

2株动物微生态制剂菌的分离鉴定及其生物学特性初步研究

目的从饲料中进行微生物的分离与培养,筛选动物微生态制剂候选菌株。方法利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)筛选得到的7株微生物区分为2种菌,经测序确定其为热带假丝酵母和植物乳杆菌;检测了不同pH、温度、胆盐、金属铜和需/厌氧对其生长的影响。结果当pH小于2.5或铜离子高于150 ppm时,植物乳杆菌无法生长,而热带假丝酵母数量略有下降;胆盐和金属离子对2种菌影响较小,42℃培养条件下相对于30℃培养时热带假丝酵母数量下降了6个数量级。结论筛选得到的2株菌具有应用于动物微生态制剂的潜力,为动物微生态制剂候选菌筛选和评价提供了基础数据。     

热带假丝酵母代谢烷烃过程中的β-氧化和代谢调控

热带假丝酵母(Candida tropicalis)能利用烷烃作唯一碳源和能源.当以烷烃或脂肪酸为碳源时,在细胞内可形成大量的过氧化物酶体(peroxisome),同时诱导生成脂肪酸β-氧化酶系,当以葡萄糖为碳源时,则极少有过氧化物酶体形成[1],一些C.tropicalis能氧化烷烃生成长链二元酸(long chain dicarboxylicacid,DCA).由于这些特征,人们从酶学、分子生物学和实际应用等方面对这种酵母进行了深入研究,并阐述了C.tropicalis代谢烷烃的途径、脂肪酸β-氧化酶系的生理功能及其几种重要酶的基因结构和酶活性的调控,阐明了它与哺乳动物细胞在脂肪酸代谢及调控方面上的差异;通过C.tropicalis突变株的筛选和发酵工艺的优化,使长链二元酸发酵技术实现了产业化[2,3].     

尿素对热带假丝酵母Candida tropicalis合成长链二元酸途径的调节 Ⅱ.几个关键酶活力的消长

前文已报道尿素及尿素结构类似物对长链二元酸的合成酶系既有抑制作用,也有阻遏作用,从而调节了长链二元酸的合成。本文进一步从离体酶系探索过量尿素对热带假丝酵母在烃类氧化过程中有关三羧酸循环,乙醛酸循环,呼吸链,ω和β氧化等几个关键酶活力的消长关系。实验结果证明,过量尿素(0.2%)以上培养菌体的三羧酸循环三个主要脱氢酶,苹果酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶(NADP)的比活力分别为正常尿素(0.1%)培养菌体的5.3、3.0、1.7倍。乙醛酸循环关键酶,异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶分别为正常尿素培养物的2.6和2.8倍。另一方面当尿素过量时ω-氧化酶系活力极微,而β-氧化酶系活力大大提高,以致长链二元酸难以积累。另外过氧化氢酶活力在过量尿素存在时也有显著提高。而谷氨酸脱氢酶、NADH氧化酶和由NAD连结的异柠檬酸脱氢酶在两种菌体内无明显差别。     

尿素对热带假丝酵母Candida tropicalis合成长链二元酸途径的调节——Ⅱ.几个关键酶活力的消长

前文已报道尿素及尿素结构类似物对长链二元酸的合成酶系既有抑制作用,也有阻遏作用,从而调节了长链二元酸的合成。本文进一步从离体酶系探索过量尿素对热带假丝酵母在烃类氧化过程中有关三羧酸循环,乙醛酸循环,呼吸链,ω和β氧化等几个关键酶活力的消长关系。实验结果证明,过量尿素(0.2%)以上培养菌体的三羧酸循环三个主要脱氢酶,苹果酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶(NADP)的比活力分别为正常尿素(0.1%)培养菌体的5.3、3.0、1.7倍。乙醛酸循环关键酶,异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶分别为正常尿素培养物的2.6和2.8倍。另一方面当尿素过量时ω-氧化酶系活力极微,而β-氧化酶系活力大大提高,以致长链二元酸难以积累。另外过氧化氢酶活力在过量尿素存在时也有显著提高。而谷氨酸脱氢酶、NADH氧化酶和由NAD连结的异柠檬酸脱氢酶在两种菌体内无明显差别。     

提高石油酵母收率的一种方法

我们在利用热带假丝酵母Y-17制备石油酵母时,并将得到的湿酵母用于提取石油蛋白胶粘剂。为了改善胶粘剂的颜色,实验中我们采用α-淀粉酶处理破壁后的酵母粉,然后离心,这样所得的液体称为“废水”。用此废水培养Y-17热带假丝酵母,发现培养过程中pH较稳定,不需加氨水调节pH,从而提高了投入液体石蜡的比例和酵母收率。     

南京地区1386株临床分离酵母的鉴定及药敏分析

本文旨在研究临床分离酵母的种类及药物敏感性。采用CHROMagar Candida显色培养基和API20CAUX对我院2008年1～12月分离自临床深部真菌感染患者的1386株酵母进行鉴定,并采用Rosco纸片扩散法分析其对两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素、伏立康唑、5-氟胞嘧啶、克霉唑的药物敏感性,数据用Whonet5.4软件分析。结果显示,分离出的1386株酵母中,白假丝酵母占58.95%,热带假丝酵母占15.95%,光滑假丝酵母占15.15%,克柔假丝酵母占2.74%,其他酵母占7.21%。葡萄牙假丝酵母、近平滑假丝酵母、白假丝酵母、热带假丝酵母、光滑假丝酵母和克柔假丝酵母对氟康唑的敏感率分别为95.45%、94.29%、82.99%、79.19%、68.57%和28.95%;白假丝酵母对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、制霉菌素、伏立康唑、氟康唑、伊曲霉唑和克霉唑的敏感率分别为93.76%、93.15%、84.58%、84.09%、82.99%、80.05%和78.09%。结果提示,我院深部真菌感染仍以白假丝酵母为主,其次是热带假丝酵母、光滑假丝酵母;白假丝酵母对5-氟胞嘧啶、两性霉素B的敏感率最高;除克柔假丝酵母外的所有酵母对氟康唑的敏感率都很高。     

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)染色体倍性分析

摘要：【目的】产甘油假丝酵母作为一株优良高产甘油菌株,已成功应用于工业生产15年。近年来由于产甘油假丝酵母染色体倍性尚不明确,限制了对其进行遗传改造的研究进展,因而我们对产甘油假丝酵母染色体倍性研究,分析确定其染色体倍性。【方法】选用酿酒酵母细胞进行生孢,制备酿酒酵母单倍体细胞作对照,并选用热带假丝酵母作为二倍体酵母细胞对照,利用血球计数板得到热带假丝酵母、产甘油假丝酵母、单倍体及二倍体酿酒酵母细胞数,提取染色体,通过二苯胺检测法测定DNA含量。由于在相同紫外照射条件下单倍体细胞比二倍体细胞更容易死亡,因     

热带假丝酵母(Candida tropiclis)去除蔗渣木聚糖酶解副产物的研究

该文研究了木糖、木糖醇对木聚糖酶Shearzyme 500L酶解蔗渣木聚糖的影响。通过热带假丝酵母(Candida tropiclis)转化酶解副产物木糖,解除木糖对木聚糖酶的抑制作用,从而获得高木二糖含量的低聚木糖。结果表明:木糖是Shearzyme 500L的酶活性抑制物,其抑制作用与溶液中的木糖量成正比;木糖醇对木聚糖酶无抑制作用;热带假丝酵母可将蔗渣木聚糖酶解液中的木糖转化为木糖醇而不利用低聚木糖,木二糖占总糖比例由53.09%升高到62.92%,经二次酶解后,木二糖比例可达78.90%。     

热带假丝酵母酰基辅酶A氧化酶的纯化及性质研究

利用热带假丝酵母由烷烃生产二元酸时,二元酸面临被β氧化降解的代谢途径。酰基辅酶A氧化酶是二元酸β氧化的限速酶。以热带假丝酵母1230菌株为材料,经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析、BlueSepharose亲和柱层析,得到电泳均一的酰基辅酶A氧化酶。该酶有两种亚基,分子量分别为74kD和78kD。酶作用最适pH和最适温度分别为80和50℃。金属离子Ag+、Pb2+完全抑制酶活性,Ba2+、Mg2+、Ca2+对酶活性有明显抑制作用。丙烯酸是酶的反竞争性抑制剂,Ki为0633mmol/L,维生素C是竞争性抑制剂,Ki为2.01×10-3mmol/L。     

H2O2对热带假丝酵母醇氧化酶的影响及其作用机理分析

考察了H2 O2 对热带假丝酵母代谢烷烃生产二元酸过程中醇氧化酶 (fattyalcoholoxidase ,AOX)的影响。研究表明 :2mmol L和 5mmol L的H2 O2 对AOX的比酶活有明显的促进作用 ,分别比对照提高了 68 2 %和 82 9%。研究还发现 ,H2 O2 是以超氧阴离子自由基等形式在胞内存在 ,并对H2 O2 在代谢过程中的作用机理进行了分析。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测口腔含漱液中假丝酵母[英]／White LP…／／J Clin Mi．crobiol．

口腔假丝酵母感染的研究需寻求可靠的标本采集和鉴定方法。近来,口腔含漱液(concentrated oral rinse culture,CRC)被推荐用于检测口腔酵母。实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)已用于临床血标本假丝酵母感染的快速检测。英国Wales大学的White等人对利用实时PCR检测CRC中假丝酵母属的方法进行了研究。方法：收集145例(男49,女96)疑患口腔假丝酵母感染患者和48例(男20,女28)健康人的CRC,将其离心沉淀物悬于1ml PBS中,取50μl接种于沙氏培养基,     

一株口腔链球菌新种—寡发酵链球菌产过氧化氢特性的研究

从健康人口腔中分离的寡发酵链球菌(Streptococcus oligofermentans)能够产生大量的过氧化氢,可能具有抑制致病菌的潜力。为了研究该细菌产过氧化氢的特性,检测了其在不同生长时期和从不同底物产过氧化氢的能力。结果表明,寡发酵链球菌从对数生长早期就开始产过氧化氢,在对数生长后期及稳定期过氧化氢产量达到最高,随后下降。在PYG培养基中,寡发酵链球菌所产的过氧化氢主要来源于大豆蛋白胨和酵母提取物;而代谢终产物乳酸也可作为过氧化氢产生的底物。对3种可能与过氧化氢生成有关的氧化酶的酶活测定表明,寡发酵链球菌具有乳酸氧化酶(LOX)及NADH氧化酶(NOX)的活性,说明其过氧化氢的产生主要依赖于这两种酶的活力。     

白假丝酵母CFL1基因通过转录调控参与氧化压力应答

【背景】CFL1基因是白假丝酵母高铁还原酶基因,介导胞外铁离子的还原,在白假丝酵母胞内铁稳态的维持方面发挥着重要作用。【目的】研究CFL1基因调节氧化压力应答的分子机制。【方法】采用液体培养及巨噬细胞模型,测定CFL1缺失对氧化压力耐受性和杀伤巨噬细胞能力的影响;使用羟基自由基清除剂二甲基亚砜(DMSO)分析其对缓解氧化压力敏感性的影响;采用实时荧光定量PCR分析CFL1缺失对氧化压力应答基因表达的影响;采用过氧化氢酶(CAT)活性测定方法研究CFL1缺失对CAT1基因表达的影响;通过构建WT-CAT1-GFP和cfl1Δ/Δ-CAT1-GFP菌株分析过氧化氢酶基因过表达对cfl1Δ/Δ氧化压力敏感性的影响。【结果】白假丝酵母CFL1基因的缺失会造成杀伤巨噬细胞能力的减弱,氧化压力应答基因表达的下降。过氧化氢酶基因的过表达则能恢复与野生型几乎一致的氧化压力水平。【结论】CFL1基因通过转录调控参与白假丝酵母氧化压力应答过程。