含不同个数基序乳酸乳球菌肽聚糖锚钩蛋白结合活性比较

【目的】比较两种含不同个数基序乳酸乳球菌肽聚糖锚钩蛋白(protein anchor,PA)的结合活性。【方法】首先应用PCR技术分别扩增得到含有2个或3个自溶素基序(Lysin Motif,Lys M)基因片段的PA2与PA3;然后应用p ET-32a(+)质粒构建原核表达载体,将其转化大肠杆菌BL-21(DE3),进行诱导表达,获得目的蛋白;最后将经复性后的PA2、PA3融合蛋白与GEM(Gram-positive Enhancer Matrix,GEM)颗粒结合,经Western blot、透射电镜与SDS-PAGE进行结合鉴定与结合活性比较分析。【结果】融合蛋白PA2、PA3复性后都能与GEM结合,PA3与GEM颗粒的结合活性明显好于PA2。【结论】含有3个Lys Ms的PA对GEM的结合活性明显优于含有2个Lys Ms的PA。本研究可为进一步完善乳球菌外壳-蛋白锚钩展示系统提供理论基础。     

鼠疫菌H-NS蛋白的表达与纯化及其DNA结合活性

摘要：【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3的表达系统,表达出有活性的鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）调控子蛋白H-NS,为进一步研究H-NS的转录调控奠定基础。【方法】 PCR扩增鼠疫菌201株hns基因的编码区,将其直接克隆入pET28a质粒中,再将pET28a-hns重组质粒转入大肠杆菌BL21λDE3菌株中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出鼠疫菌His-H-NS蛋白;通过体外的凝胶迁移实验（EMSA）和DNaseⅠ足迹实验对His-H-NS蛋白与DNA的结合活性进行分析。【结果】成功表达出有活性的鼠疫菌His-H-NS蛋白,该蛋白对鼠疫菌pH6抗原基因（psaA、psaE）及rovA基因均有结合活性。【结论】鼠疫菌His-H-NS具有DNA结合活性,说明H-NS能调控鼠疫菌基因的转录。     

苏云金芽胞杆菌dxr1基因的转录受SigH控制

【目的】萜类化合物广泛分布在生物界,是重要的生命物质。目前发现有两条萜类化合物的生物合成途径,即甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径。MEP代谢途径中的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(DXR,EC1.1.1.267)催化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸生成MEP。枯草芽胞杆菌中dxr基因编码DXR酶,而在苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)中有2个基因(dxr1和dxr2)编码DXR酶。通过分析BtHD73菌株的dxr1基因的转录活性和dxr1突变体表型,明确dxr1基因的转录调控机制和功能。【方法】通过5?RACE分析dxr1的转录起始位点;β-半乳糖苷酶活性测定分析dxr1基因启动子(Pdxr1)的转录活性;采用同源重组技术分别敲除BtHD73菌株的dxr1和dxr2基因;利用总蛋白定量确定Cry1Ac蛋白产量;利用DXR检测试剂盒检测Bt菌株的DXR活性。【结果】dxr1基因的转录起始位点位于起始密码子上游39 bp处的G碱基;与出发菌株HD73相比,Pdxr1在sig H突变体中的转录活性明显降低;dxr1或dxr2基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无显著影响,但使DXR活性下降。【结论】Bt中dxr1基因的转录受Sig H控制,dxr1基因的缺失影响DXR的活性。     

副溶血弧菌ToxR截短体蛋白的表达纯化及其DNA结合活性

【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3表达系统,表达出有活性的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)ToxR截短体蛋白,为进一步研究ToxR的转录调控机制奠定基础。【方法】以VP基因组DNA为模板,PCR扩增ToxR蛋白DNA结合结构域(ToxR-N)的DNA片段,并将其直接克隆入pET28a中,获得重组质粒;将重组质粒导入大肠杆菌BL21λDE3中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出His-ToxR-N蛋白。利用限制级凝血酶切除His-ToxR-N中的His-标签,进而以VP的calR和VP1687为靶基因,通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)验证ToxR-N蛋白的DNA结合活性。分别构建克隆有calR和VP1687上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入野生株(WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中,通过测定β-半乳糖苷酶活性来比较两株重组菌中靶基因启动子活性,以验证ToxR对calR和VP1687的调控关系。【结果】成功表达出有活性的ToxR-N蛋白,该蛋白对calR启动子区具有结合活性。LacZ结果显示ToxR对calR的转录具有激活作用,而对VP1687的转录具有抑制作用。【结论】所表达的ToxR-N可用于后续的转录调控机制研究;ToxR通过直接激活calR的转录表达,而间接抑制T3SS1相关基因的表达。     

荧光发光杆菌TT01品系pirA2B2 基因的克隆表达与杀虫活性

【目的】Photorhabdus luminescens TT01基因组中的一对ORF plu4437-plu4436(简称pirA2B2)的预测氨基酸序列与另一对已证明编码产物有口服杀虫活性的ORF plu4093-plu4092(简称pirA1B1)有50%和45%的一致性,本文旨在研究pirA2B2基因座的表达产物是否也有杀虫活性。【方法】PCR扩增并克隆了pirA2,pirB2和pirA2B2基因,构建了重组表达载体pQE-pirA2,pQE-pirB2和pQE-pirA2B2并分别转入M15菌株表达,经SDS-PAGE和Western blot检测证明,3个重组菌株经IPTG诱导后,分别成功表达了可溶的PirA2,PirB2和PirA2B2蛋白。用亲和层析结合脱盐技术对3个重组菌株表达的外源蛋白分别进行纯化,并通过生物测定确定纯化蛋白的杀虫活性。【结果】生物测定结果显示联合表达的PirA2B2对大蜡螟和斜纹夜蛾五龄幼虫均有明显的血腔杀虫活性,LD50分别为每虫4.0和2.8μg,单独表达的PirA2或PirB2对上述2种害虫没有血腔杀虫活性,但两者的混合物具有与两者联合表达相似的杀虫活性;PirA2B2对大蜡螟和斜纹夜蛾初孵幼虫均无口服杀虫活性。【结论】pirA2B2是P.luminescens TT01菌株基因组中的另一个二元杀虫毒素基因。【意义】pirA2B2的成功克隆表达和杀虫功能的确定为进一步研究其与pirA1B1的关系以及该基因的表达调控等打下了基础。     

耻垢分枝杆菌MSMEG_6281 过表达对菌株生长和形态的影响

【目的】耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2155,mc2155)MSMEG_6281为结核分枝杆菌自溶素Rv3717的同源蛋白,通过建立过表达MSMEG_6281的耻垢分枝杆菌菌株,推测该蛋白对耻垢分枝杆菌肽聚糖代谢的影响。【方法】利用RT-PCR方法检测乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)作用后MSMEG_6281基因的表达变化;以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆MSMEG_6281基因,构建分枝杆菌表达质粒p VV16-MSMEG_6281,进一步建立MSMEG_6281过表达的耻垢分枝杆菌菌株;利用生长曲线检测MSMEG_6281过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响;利用扫描电子显微镜分析MSMEG_6281过表达引起的耻垢分枝杆菌形态变化。【结果】EMB处理引起MSMEG_6281基因表达上调;构建了过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌菌株(mc2155/p VV16-MSMEG_6281);过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌生长缓慢,菌体形态由短杆状转变为长杆状。【结论】MSMGE_6281的过表达可改变耻垢分枝杆菌形态。MSMGE_6281的功能与细胞壁肽聚糖水解相关,在mc2155细胞壁形态维持方面发挥重要作用。     

二化螟APN1的原核表达及其与Cry2Aa蛋白的结合特性研究

【目的】Bt杀虫蛋白发挥杀虫活性的重要前提是Cry蛋白能够与昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊(BBMVs)上的受体蛋白结合。在前期获得二化螟氨肽酶N1(Aminopeptidase N,APN1)基因全长序列的基础上,明确二化螟APN1多肽片段与Cry2Aa的结合能力。【方法】将二化螟APN1序列片段在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用蛋白质单向电泳和ligand blotting技术分析二化螟APN1多肽片段与Cry2Aa的结合能力。【结果】重组载体可在表达菌株BL21(DE3)中表达一个约70 ku的蛋白,纯化后的多肽条带单一,纯度较好。Ligand blot分析结果显示,表达的二化螟APN1多肽片段可以与活化的Cry2Aa杀虫蛋白结合,且结合条带随着重组蛋白上样量的降低而减弱。【结论】APN1多肽片段可以与Cry2Aa结合,为阐明APN1基因的功能奠定基础,也为其他Bt蛋白的受体蛋白相关研究提供新的借鉴。     

耻垢分枝杆菌中一个TetR家族转录因子负调控异烟肼的敏感性

[目的] 研究TetR家族转录因子Ms0606对耻垢分枝杆菌耐药性的调控作用。[方法] 首先,通过测定生长曲线检测Ms0606在分枝杆菌耐药性中的调控作用;通过凝胶迁移阻滞实验和DNase I足迹法鉴定转录因子Ms0606识别的保守序列,进而探究其潜在的靶基因;其次,利用逆转录-qPCR和β-半乳糖苷酶活性实验检测Ms0606对靶基因Ms0608的调控作用,进一步探讨Ms0606调控分枝杆菌耐药性的分子机制。[结果] 与野生型菌株相比,Ms0606超表达菌株对异烟肼表现为敏感,Ms0606敲除菌株对异烟肼表现为抗性;Ms0606可以识别其自身操纵子上游区域内保守的22 bp回文序列,利用回文序列搜索耻垢分枝杆菌的基因组,发现Ms0606可能调控5个潜在靶基因;逆转录-qPCR和β-半乳糖苷酶活性实验显示Ms0606作为抑制子负调控Ms0608的表达,这可能会影响分枝杆菌对药物的耐药性。[结论] 鉴定了一种新的由Ms0606编码的耻垢分枝杆菌的TetR家族转录调控因子,该因子可调节分枝杆菌对异烟肼的敏感性,并进一步探讨其对靶基因的调控功能及对分枝杆菌耐药性的调控机制。     

水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)β-微管蛋白基因克隆及与多菌灵抗药性关系

【目的】揭示水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)对多菌灵的抗药性与其β-微管蛋白基因的相关性。【方法】结合形态学和TEF-1α基因序列对分离菌株进行鉴定;根据近源种拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)核基因组测序菌株7600的β-微管蛋白核苷酸序列设计引物,采用PCR方法克隆并比对分析了F.fujikuroi对多菌灵不同敏感性表型的5个菌株的β-微管蛋白基因全序列;利用实时定量技术(qRT-PCR)分析了β-微管蛋白基因在上述5个菌株中的表达特性。【结果】F.fujikuroi的β-微管蛋白基因核苷酸序列(GenBank登录号:JQ026022)全长1671 bp,包含4个内含子,编码447个氨基酸残基;2个敏感性菌株和3个抗药性菌株的β-微管蛋白基因核苷酸序列同源性100%;在无药剂处理下该基因在2个敏感性菌株中的表达水平显著高于3个抗药性菌株(p=0.05),且对同一菌株而言,药剂处理能够显著提高β-微管蛋白基因表达水平(p=0.05),但在相同药剂处理条件下,菌株间差异不显著。【结论】F.fujikuroi对多菌灵的抗药性机制与β-微管蛋白无关,有待进一步研究。     

二化螟钙黏蛋白CAD1的原核表达及与Cry1Ac、Cry2Aa蛋白的结合

【目的】二化螟是水稻的重要害虫之一,钙黏蛋白(cadherin,CAD)是一类重要的Bt杀虫蛋白受体,在获得二化螟钙黏蛋白基因(Cs CAD1)的基础上,明确Cs CAD1蛋白与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力。【方法】利用PCR技术克隆Cs CAD1基因片段,将构建的p ET-28a-(+)-Cs CAD1重组质粒转入原核表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。目的蛋白经Ni柱亲和纯化后SDS-PAGE电泳检测,利用western blot和ligand blot技术分析其与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力。【结果】重组载体可在表达菌株BL21中表达一个约44 ku的蛋白,原核表达载体构建成功。SDS-PAGE显示该蛋白条带单一,且纯度较好。Ni柱亲和层析纯化该目的蛋白后进行Ligand blot分析,结果显示Cs CAD1重组蛋白可以与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合。【结论】Cs CAD1蛋白可以与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合,是潜在的Cry蛋白受体,所得结果有助于阐明Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对二化螟的作用机制。     

白念珠菌CaGDT1基因的功能研究

人类跨膜蛋白TMEM165与酿酒酵母Sc Gdt1均属于阳离子/钙离子交换器家族的成员,在本研究中,通过序列比对在白念珠菌中发现了Sc GDT1的同源基因Ca GDT1,表型互补实验显示Ca GDT1基因的表达能够抑制Sc GDT1基因缺失所造成的钙离子敏感性,证明Ca GDT1是Sc GDT1的同功基因。此外,通过同源重组原理敲除了Ca GDT1的2个等位基因。表型筛选结果表明gdt1/gdt1缺失株对钙离子、细胞壁和内质网3种胁迫均不敏感,而对酮康唑和特比萘芬2种抗真菌药物具有耐受性。     

鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株的构建及其耐药性

[背景]鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种重要的人兽共患病原菌,其多重耐药性问题日益严重,双组分系统可调控鼠伤寒沙门氏菌的耐药性。[目的]通过构建鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株及回补株探究BaeSR双组分系统对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响。[方法]在BaeSR双组分系统和AcrB外排泵双缺失株（CRΔbaeSRΔacrB）的基础上构建baeR过表达株（CRpbaeRΔbaeSRΔacrB）及baeR回补株（CRcbaeRΔbaeSRΔacrB）,测定双缺失株、回补株和过表达株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）,并对其生长特性、生物膜形成能力及运动性进行分析。采用转录组学技术筛选与耐药相关的差异表达基因,RT-qPCR验证耐药相关基因。[结果]构建了鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株和baeR回补株。与双缺失株相比,过表达株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、乙酰甲喹、头孢他啶、头孢噻呋、阿莫西林和氨苄西林的MIC分别升高2-256倍,对大观霉素、安普霉素的MIC下降了50%;与双缺失株相比,回补株对头孢他啶...     

白念珠菌CaSPO75基因的敲除与功能研究

酿酒酵母中ScCsc1是一个最近鉴定的钙离子通透性压力门控阳离子通道蛋白,参与调控胞内离子稳态。ScSpo75是ScCsc1的一个同源蛋白,可能参与孢子壁的装配过程。在白念珠菌中存在一个与ScSPO75同源的基因CaSPO75,其功能尚不清楚,因此采用SAT1-flipper方法敲除CaSPO75的两个等位基因以研究其功能。通过表型筛选,发现该基因的缺失导致白念珠菌对特比萘芬(Teb)、荧光增白剂(CFW)、氯化锰和氯化锌耐受,对酮康唑(KCZ)敏感。因此,CaSPO75基因可能参与白念珠菌耐药性和细胞壁压力反应的调控,以及胞内锰离子和锌离子稳态的调控。     

A prenylated dihydroflavonol from Mundulea suberosa

A new prenylated dihydroflavonol was isolated from Mundulea suberosa and characterised as 5-methyl lupinifolinol by spectral data. Its antibacterial activity was studied.     

鸭疫里默氏杆菌流行菌株的分离鉴定及生物学特性

【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起雏鸭、鹅、火鸡等多种家禽、野禽发生传染性浆膜炎的病原,在全世界范围内广泛存在,危害养禽业发展,造成严重的经济损失。【目的】了解国内RA的流行现状,探究该菌的生物学特性,更好地指导防控鸭疫里默氏杆菌病。【方法】对2020-2021年从山东省、河北省、广东省、山西省等地分离的RA疑似菌株进行PCR、生化和血清型鉴定,并根据药物敏感性结果分析耐药现象,根据半数致死量(median lethal dose,LD₅₀)测定结果分析致病力差异。【结果】共鉴定78株RA分离株,其中,血清1型4株、2型21株、10型11株、6型3株、7型17株,1株有交叉凝集现象,21株血清型未定型;药敏结果显示78株分离株对多粘菌素B、磷霉素、克林霉素等的耐药性最强,对头孢拉定、多西环素、呋喃唑酮、氟苯尼考等抗生素最为敏感,并且78株分离株均存在多重耐药性,其中77株耐药5重及以上;动物试验结果显示,RA的分离株致病力普遍较强,而且不同地区分离株、同地区不同分离株之间均存在差异,数株RA分离株的LD₅₀在10⁴-10⁷ CFU不等。【结论】RA在国内流行表现了强致病力及严重耐药情况,本研究结果为更好地预防控制、临床用药及后续致病机制研究提供了参考依据。     

志贺菌耐药性与非编码RNA的关系研究

采用RNA-seq技术对志贺菌耐药性与非编码RNA之间的关系进行研究。首先采用梯度剂量的环丙沙星诱导福氏志贺菌2a标准菌株产生耐药性而获得耐药菌株,然后提取标准菌株与耐药菌株的总RNA进行RNA-seq分析。结果显示,在福氏志贺菌的2个样品中共发现100个候选sRNA,并与sRNA的数据库比对得到注释信息,每个候选sRNA都对应着很多个靶标基因,而且靶标基因的表达也有明显差异。预测这些sRNA可能会通过调控耐药基因和一些与细胞增殖或凋亡相关的基因发挥作用,因此还需要挑选合适的候选sRNA并对其用荧光定量PCR实验进行验证。     

鳜源致病性舒伯特气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

【背景】舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)广泛分布于淡、海水水体和底泥中,致病株已在我国养殖鳢科鱼类中流行,也感染其他经济鱼类,导致暴发性死亡。【目的】对病鳜(Siniperca chuatsi)的病原进行鉴定,确定分离菌的致病性及药物敏感性,为该病临床治疗提供参考。【方法】采集病鳜脾肾组织进行PCR或RT-PCR扩增其常见病毒,采集病鳜肝脏和腹水分离培养细菌,PCR扩增代表菌株的gyrB、16S rRNA和毒力基因,鉴定其生理生化特征,并进行药物敏感性试验和人工感染试验。【结果】病鳜的传染性脾肾坏死病毒、鳜蛙病毒、鳜弹状病毒检测结果为阴性,肝脏和腹水均存在大量细菌;代表菌株Gui210820被鉴定为舒伯特气单胞菌,携带溶血素、气溶素、弹性蛋白酶和磷脂酶毒力基因,腹腔注射感染鳜的半数致死浓度(LD50)为3.16×105 CFU/mL;菌株Gui210820对四环素、卡那霉素、复方新诺明等6种抗菌药物耐药,对强力霉素中介,对恩诺沙星、新霉素、氟苯尼考等11种抗菌药物敏感。【结论】本试验从病鳜组织分离到致病性舒伯特气单胞菌,水产准许用药物恩诺沙星、新霉素、氟苯尼考...     

Purification and structure of mutacin B-Ny266: a new lantibiotic produced by Streptococcus mutans

Mutacins are bactericidal substances of proteinaceous nature produced by Streptococcus mutans. Lantibiotics are antibacterial substances containing post-translationally modified amino acids such as lanthionine. Mutacin B-Ny266 was purified from the cell pellet of S. mutans strain Ny266 by ethanol extraction at pH 2.0 followed by reversed-phase chromatography (Sep-Pak® cartridge) and by HPLC on a C₁₈ column. The mean purification factor was 3240±81 and the mean yield was 1.0±0.1%. Molecular mass of mutacin B-Ny266 as determined by mass spectroscopy is 2270.29±0.21 Da. The amino acid sequence of the purified active fraction was obtained by Edman degradation after treatment with alkaline ethanethiol. Twenty-one amino acids were detected in this analysis. Mutacin B-Ny266 belongs to the type A lantibiotics. The proposed sequence is: F–K–

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–W–U–F–

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–

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–P–G–

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–A–K–O–G–

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–F–N–

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–Y–

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. The molecule differs from that of epidermin/staphylococcin 1580 and gallidermin at positions 1, 2, 4, 5 and 6.     

猪链球菌生物被膜形成的耐药机制

猪链球菌病(Streptococcus suis)是一种严重影响各国养猪业发展和人类健康的人兽共患传染病,可以引起败血症、关节炎、脑膜炎等多种疾病,造成巨大的经济损失。猪链球菌生物被膜的形成是导致其致病性和耐药性增加的主要原因。为了预防和治疗猪链球菌病以及解析其耐药的可能机制,深入了解和掌握猪链球菌生物被膜的形成和耐药机制具有重要意义。本文综述了猪链球菌生物被膜形成和耐药机制的最新科学知识,着重从生化因素、生理因素、分子机制和环境改变等方面总结讨论猪链球菌生物被膜的耐药机制,进一步为该病的防治提供科学的理论依据。