亚稀褶红菇对SD大鼠肾功能的影响

以SD大鼠为研究对象,用霍恩氏法(Horn法)计算亚稀褶红菇的半数致死剂量(LD₅₀),测定亚稀褶红菇对大鼠尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、钾(K)、钠(Na)、氯(Cl)、白细胞(WBC)计数及分类、尿蛋白、尿糖和潜血水平的影响,并对左侧肾脏进行病理学观察。亚稀褶红菇对雌性SD大鼠的LD₅₀及95%可信区间(95%CI)为271 (169–441) mg/kg,雄性SD大鼠的LD₅₀及95%CI为233 (143–378) mg/kg;与对照组比,各亚稀褶红菇组SD大鼠BUN、CREA、K、WBC计数、中性粒细胞比例、尿蛋白、尿糖和潜血的发生率及严重程度均增加;各亚稀褶红菇组SD大鼠Na和Cl均降低;各亚稀褶红菇组大鼠SD肾小管坏死,表现为上皮细胞空泡变性和水样变性,刷状缘消失,管腔内可见脱落的上皮细胞;且随着亚稀褶红菇剂量的增加,各指标变化更显著。亚稀褶红菇可导致SD大鼠肾损伤,并呈剂量反应关系。     

卫氏并殖吸虫PCR和实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的建立快速、灵敏、特异的分子生物学检测卫氏并殖吸虫的方法。方法根据卫氏并殖吸虫的特异性基因序列,设计适合于PCR检测的特异性引物及实时荧光PCR特异性引物和探针,并进行灵敏性和特异性试验。结果设计的引物和探针特异性强,所建立的检测方法灵敏度高。应用实时荧光PCR方法的检测灵敏度可达到0.1 pg/μL,比PCR方法的灵敏度高三个数量级。结论本研究所建立的PCR和实时荧光PCR技术检测卫氏并殖吸虫方法的特异性强,灵敏度高,为卫氏并殖吸虫感染的诊治提供了快速的检测技术手段。     

水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR快速检测鉴定

成功建立了水稻白叶枯菌与水稻细菌性条斑病菌快速检测鉴定的实时荧光PCR方法。根据含铁细胞接受子基因设计两菌的通用引物PSRGF/PSRGR（扩增一个152bpDNA片段）和特异性探针（Baiprobe和Tiaoprobe）,并对13种细菌和1种植原体进行实时荧光PCR。结果表明,两个特异性探针能分别特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其它参考菌不产生荧光信号。检测的绝对灵敏度是30.6fg/μL质粒DNA和103CFU/mL的菌悬浮液,相当于1个细菌细胞的基因,比常规PCR电泳检测高约100倍,相对灵敏度为105CFU/mL。整个检测过程只需2h,完全闭管,降低了污染的机会,无需PCR后处理。 用这两个特异性探针分别对自然感染白叶枯菌和条斑菌的叶片DNA提取液和种子浸泡液进行实时荧光PCR,结果均可特异性检测到目标菌的存在并完全可将两种病原细菌区分开来,且只需03g叶片和10g种子。     

TaqMan—MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明:引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。     

产气荚膜梭菌实时荧光PCR方法的建立

目的:利用荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的检测产气荚膜梭菌的方法。方法:以产气荚膜梭菌基因为靶序列设计引物和探针,以自产气荚膜梭菌菌株中提取的DNA为模板,优化引物和探针的浓度比,同时验证方法的特异性、敏感性。结果:建立的反应体系在上游引物浓度为0.45μmol/L、下游引物浓度为0.15μmol/L、探针浓度为0.3μmol/L时,具有良好的特异性和敏感性,与创伤弧菌等12种相关细菌均无交叉反应;对纯菌检测的灵敏度低于10 CFU/反应体系。结论:建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对战时气性坏疽做出快速准确的报告,实现对这种战时高发疾病的安全、快速和定量检测。     

肠球菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的利用TaqMan荧光定量PCR方法,建立肠球菌实时荧光PCR检测方法,并初步应用于粪便中肠球菌的检测。方法根据GenBank发表的肠球菌23S rRNA基因序列的保守区域参考国外文献设计合成特异性的引物和探针[1];利用构建的质粒标准品优化Mg2 的浓度和引物探针浓度,并考核检测体系的保守性、灵敏性和重复性;初步应用于粪便标本的检测分析。结果Mg2 终浓度为4.5 mmol/L,上下游引物终浓度为0.4μmol/L,灵敏度为6拷贝数/反应;绘制两种标准曲线,构建了基因拷贝数、细菌数为分析指标的定量分析模型,检测粪便标本结果显示TaqMan荧光定量PCR方法较平板计数法敏感、快捷、简便。结论本研究建立了一种灵敏、特异、简便易行的肠球菌定量检测方法。     

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒.针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析.结果表明引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应.方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好.本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测.     

亚稀褶黑菇和稀褶黑菇的ITS序列分析

对亚稀褶黑菇和稀褶黑菇的ITS全序列进行了测定和比较,首次报道了亚稀褶黑菇的ITS1和5.8S区域。在ITS区域中,不同采集地的亚稀褶黑菇与稀褶黑菇的5.8S rDNA具有100%的同源性,而两侧ITS之间表现出种内和种间的多态性,种内的差异均不超过5%,种间的差异达10%左右。ITS序列分析方法可以作为两者的鉴定方法。     

实时荧光PCR快速检测食品中致敏原芹菜成分

探讨采用实时荧光PCK技术建立检测食品中致敏原芹菜成分的方法.试验结果表明:针对芹菜管家基因Mrd基因设计的特异性检测引物和探针进行检测时,31种样品经实时PCR扩增,只有芹菜和西芹样品产生阳性的荧光信号,其余样品均不产生荧光信号.灵敏度试验结果表明:该方法对芹菜致敏原基因的检测灵敏度较高,可检测到芹菜过敏原样品中10mg/kg～1mg/kg的含量.     

亚稀褶黑菇和稀褶黑菇的ITS序列分析

对亚稀褶黑菇和稀褶黑菇的ITS全序列进行了测定和比较,首次报道了亚稀褶黑菇的ITS1和5.8S区域.在ITS区域中,不同采集地的亚稀褶黑菇与稀褶黑菇的5.8S rDNA具有100%的同源性,而两侧ITS之间表现出种内和种间的多态性,种内的差异均不超过5%,种间的差异达10%左右.ITS序列分析方法可以作为两者的鉴定方法.     

中国南方变绿红菇近似种类“青头菌”的物种多样性

本研究以我国西南、华中和华东部分地区变绿红菇近似种类“青头菌”为研究对象,使用形态学和rDNA ITS区段核苷酸序列分析相结合的方法进行鉴定。结果表明,“青头菌”多数子实体属于变绿红菇Russula virescens复合群,其余子实体为绿桂红菇R. viridicinnamomea、红边绿菇R. viridirubrolimbata和本文描述的新种拟壳状红菇R. pseudocrustosa。在形态特征和ITS核苷酸序列方面,我国变绿红菇近似种R. aff. virescens与欧洲的变绿红菇R. virescens和北美的小变绿红菇R. parvovirescens均存在一定差异。变绿红菇近似种类在亚洲的分布范围较广,物种准确划分尚需进一步深入研究。     

中国红菇属乳菇状亚组的三个新种

红菇属乳菇状亚组Russula subsect. Lactarioideae是一个形态特征较明显的类群,亚属内部分种类被认为是复合种。在对我国红菇属乳菇状亚组进行的分类学研究中,发现了3个新种：丝黄红菇Russula byssina、奶油色红菇R. cremicolor和白果红菇R. leucocarpa,均产自我国贵州省,生于针叶林下。基于形态详细观察和ITS序列系统发育分析的结果对其进行详细描述,对新种和近缘种间差异进行了比较和讨论,提供了新种与乳菇状亚组和淡孢亚组R. subsect. Pallidosporinae中近缘种的物种检索表。分子系统学结果显示奶油色红菇与Delica-Brevipes分支亲缘关系较近,白果红菇和丝黄红菇隶属于两个独立分支。     

Differentiation of Staphylococcus spp. by terminal-restriction fragment length polymorphism analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-encoding gene

Classical phenotypic and biochemical testing do not lead to correct identification of the distinct Staphylococcus species. Therefore, the aim of our study was to develop a method for the reliable and accurate determination of distinct Staphylococcus species.

In the present study, the 931–934-bp partial sequences of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-encoding (gap) gene of 28 validly described Staphylococcus species were amplified and sequenced. By using the respective sequence information we performed a terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis. For T-RFLP the partial gap gene was amplified with double-fluorescently labelled primers and digested with the restriction enzymes DdeI, BspHI and TaqI. Distinctive T-RFLP patterns were rendered by the use of capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. This molecular method allowed us to identify all 28 Staphylococcus species with high specificity. This was validated by analysis of 34 Staphylococcus epidermidis and 28 Staphylococcus haemolyticus isolates.

These results demonstrate the feasibility and applicability of the T-RFLP method based on the partial gap gene sequences for rapid and accurate species identification.     

云南蘑菇中毒事件中的毒蘑菇物种多样性

近年来,云南省每年发生超过500起蘑菇中毒事件,造成2 000余人中毒,约30人死亡,成为我国蘑菇中毒危害最为严重的省份。系统研究蘑菇中毒事件中的毒蘑菇多样性,可以为蘑菇中毒精准防控提供科学依据和技术支撑。本研究对云南省2013年以来开展过科学物种鉴定的223起中毒事件进行了系统分析,发现云南省蘑菇中毒一年四季均有发生,主要集中在6-9月份,中毒事件数和中毒人数7月份达到高峰,而6月份死亡人数最多。地区分布分析发现云南省蘑菇中毒事件涉及14个市州,中毒事件数前5位分别为德宏、玉溪、保山、楚雄和普洱,均位于云南中部及以南地区。223起中毒事件中共成功鉴定出47种毒蘑菇,分属6种中毒类型(急性肝损害型、急性肾衰竭型、横纹肌溶解型、胃肠炎型、神经精神型和光敏性皮炎型)。这些毒蘑菇包含发现于中国的新物种16种,以及2019年以来发现的中国新记录种3种。致命鹅膏Amanita exitialis和亚稀褶红菇Russula subnigricans分别造成19人和9人死亡,是云南省最危险的2种剧毒蘑菇。青褶伞Chlorophyllum molybdites、日本红菇R. japonica、光硬皮马勃Scleroderma cepa、近江粉褶菌Entoloma omiense和发光类脐菇Omphalotus olearius位列胃肠炎型中毒的前5位。热带紫褐裸伞Gymnopilus dilepis、毒歧盖伞近似种Inosperma cf. virosum和兰茂牛肝菌Lanmaoa asiatica位列神经精神型中毒的前3位。叶状耳盘菌Cordierites frondosus是目前云南省造成光敏性皮炎型中毒的唯一物种。     

健康与患病刺梨植株可培养叶际真菌菌群差异比较

本研究比较了健康与患叶斑病刺梨植株叶际真菌群落特征差异,以期探索病原菌的潜在来源,为人工构建具拮抗功能群落和刺梨叶斑病的生物防控提供参考。通过可培养方法对不同健康状况的刺梨叶际真菌进行分离培养,结合形态学和分子系统学对菌株进行综合鉴定;利用FUNGuild平台对真菌进行功能注释;结合根际、根部真菌作拆分网络分析探索病原菌的潜在来源。本研究结果表明：1）刺梨叶际真菌具有丰富的多样性。从刺梨叶际8个样品中共分离到真菌266株,其隶属于3门、6纲、13目、30科、46属中的61个种。其中,健康植株叶际内生真菌（LHE）包括8属10种27株,附生真菌（LHS）包括33属37种77株。患病叶际内生真菌（LDE）分离到7属10种38株;附生真菌（LDS）分离到31属35种124株。2）不同样品的真菌优势属和特有类群有差异。不同健康状况下叶际附生真菌的优势属均为拟盘多毛孢属Pestalotiopsis,但二者的相对多度存在差异,LHS为11.49%,LDS为32.26%;内生真菌优势属二者均为链格孢属Alternaria,但相对多度各异,LHE为33.33%,LDE为63.16%。其中,LHE特有类群为盘长孢状刺盘孢 Colletotrichum gloeosporioides和果生刺盘孢Colletotrichum fructicola等8种;LDE特有类群为茄链格孢 Alternaria solani和Didymella sinensis 等8种;LHS特有类群是草酸青霉Penicillium oxalicum和Peniophora crassitunicata等21种;LDS特有类群是尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、赭绿青霉Penicillium ochrochloron和易脆毛霉Mucor fragilis等19种。3）不同样品叶际真菌功能不同。经FUNGuild解析表明,LHS、LHE和LDE的叶际真菌功能群主要以腐生型为主,LDS则主要以植物病原菌群为主。本研究结果初步揭示刺梨植株健康与患叶斑病叶际间真菌多样性、群落组成及营养功能群存在差异,植株健康状况与其真菌群落特征密切相关;叶斑病病原菌主要源于刺梨叶际的附生微生物群。     

基因组SNP揭示少根根霉种群结构

少根根霉在自然界分布广泛,是重要的食品发酵菌,又是著名的机会致病菌,在形态和生化上多样性丰富,包括原变种、德氏变种和东京变种等3个分类学变种,原型、德氏型、东京型和鲁氏型等4个形态型,以及乳酸组和富马苹果酸组等2个生化组。DNA分子多样性更为丰富。但这些多样性之间缺乏系统的关联研究。本研究选择能代表以上多样性的67个菌株,通过全基因组重测序提取ITS、IGS rDNA和SNP多态性位点进行分子系统发育和群体结构分析,结果将少根根霉分为4个主要的系统发育分支,分支1和2是姐妹群关系,共同构成德氏变种,另外两个分支分别对应东京变种和原变种。鲁氏形态型多系,源自原变种和德氏变种。群体结构分析表明在少根根霉物种内,德氏变种首先分歧出来,然后东京变种和原变种发生分化,最后3个变种分化出各自的亚群;这些亚群表明少根根霉物种正沿着8个相互杂交的分子群体进行演化。本研究首次利用基因组范围的信息支持所有的生态群、分类学变种、形态型、生化组和系统发育分支仍然属于同一个物种,物种分化尚未完成,同时实现了对少根根霉多个DNA分子群体的解析并推导出其演化规律。     

羊肚菌栽培菌株遗传多样性分析及种特异性RAPD-SCAR标记开发

近年来中国的羊肚菌Morchella spp.栽培技术取得了长足进步,但基础研究薄弱影响其稳产和高产,国内外尚无羊肚菌栽培菌株种质资源遗传多样性的研究报道。本文对来自全国12省份的36个羊肚菌栽培菌株进行了ITS系统发育分析,并采用RAPD进行了遗传多样性评价。结果表明,结合有效的参考菌株序列,通过ITS序列分析可以将供试菌株进行区分和鉴定,在36个菌株中,26个菌株属于梯棱羊肚菌Morchella importuna,其他10个菌株属于六妹羊肚菌M. sextelata;将自40条RAPD引物中筛选出的14条用于供试菌株遗传多样性分析,共扩增出124条多态性条带;UPGMA聚类可将供试菌株分为两大类群,分别对应于ITS系统发育分析中的梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌两个物种,梯棱羊肚菌种内菌株多态性高于六妹羊肚菌。OPA17引物和OPA18引物分别在AA02和AA15菌株中扩增出具有唯一性的特征条带,对两个特征条带进行回收测序后,设计出两个特异性SCAR的引物,它们能有效地从36个供试菌株群体中将菌株AA02和AA15鉴别出来。本文首次全面系统地采用ITS分析鉴别了我国羊肚菌栽培菌株的种性,采用RAPD分子标记系统地评价了羊肚菌栽培菌株的遗传多样性,并验证了RAPD分子标记转化为菌株特征性SCAR标记的可行性。     

致死性中线肉芽肿分离的不规则毛霉与米根霉致小鼠非典型增生研究

致死性中线肉芽肿（LMG）与鼻眶脑真菌病（ROCM）均为发生于面中线部位的损毁性溃疡,有时LMG可合并真菌感染,后者常被认为是继发。我们从LMG组织中分别分离出不规则毛霉（PUTH 10050641）和米根霉（PUTH 20111112）,病人均经抗真菌治疗获得痊愈,我们因此推测PUTH 10050641和PUTH 20111112可能参与诱导非典型增生及CD-56和Ki-67抗原表达。为论证上述推测,我们用ICR小鼠设计了一项观察研究。方法为小鼠背部皮下接种PUTH 10050641和PUTH 20111112,分别于接种后1周、2周、3周、4周和5周进行皮肤标本培养和组织学分析,包括直接免疫荧光和免疫组化特征。结果成功诱发感染并形成溃疡,病理表现为多形细胞浸润性炎症、血管侵入。此外,一些区域出现非典型增生、CD-56和Ki-67抗原表达,其中Ki-67高表达围绕真菌菌丝周围。上述研究表明不规则毛霉PUTH 10050641和米根霉PUTH 20111112参与了诱导非典型增生及NK细胞聚集。     

基于整树称重法的Granier经验公式对毛白杨树干液流测定的适用性

为了评估Granier经验公式在树干液流测定中的适用性,以毛白杨为对象,利用热扩散式探针法(TDP)测定树木的液流速率,以整树称重法进行同步测定,对比分析Granier经验公式在毛白杨树干液流测定中是否存在误差,并对整树称重法测定的蒸腾速率与热扩散法测定的温差系数K进行幂指数回归拟合,建立校正的Granier公式。结果表明:与整树称重法测定的蒸腾速率相比,通过Granier经验公式计算的液流速率低估了67.7%;建立了毛白杨的Granier校正公式F_d=0.0135K^0.6952(R²=0.77),校正后Granier公式的计算结果与整树称重法测定的蒸腾速率相比仅降低了3.4%,具有较好的一致性。因此,采用Granier经验公式计算毛白杨树干液流速率需进行校正。     

不同植被恢复模式下矿区复垦土壤真菌群落组成及多样性

本研究利用Illumina MiSeq高通量测序技术,分析安太堡露天煤矿生态复垦区4种植被恢复模式(刺槐Robinia pseudoacacia、油松Pinus tabulaeformis、沙棘Hippophae rhamnoides和柠条锦鸡儿Caragana korshinskii)土壤真菌群落组成及多样性,并探究其与土壤环境因子的相关性。高通量测序结果共获得821 508条有效序列和1 841个OTUs,子囊菌门Ascomycota和担子菌门Basidiomycota为优势菌门,序列数占真菌总数的88.43%,此外还含有3.72%未被分类学鉴定的真菌。真菌α多样性分析结果表明：刺槐模式、沙棘模式和柠条锦鸡儿模式的Sobs指数、Chao1指数、Ace指数和Shannon指数均显著高于油松模式(P<0.01),而油松模式的Simpson指数显著高于其余3种植被恢复模式(P<0.05)。真菌β多样性分析结果显示：OTU水平下4种植被恢复模式土壤真菌群落组成差异显著(R=0.709 9,P=0.005),其中,油松模式的土壤真菌群落与其他3种模式距离较远,差异显著(P<0.01),而其余3种植被恢复模式之间两两组成相近,差异不显著(P>0.05)。通过土壤理化性质的测定、典范对应分析、冗余分析以及Spearman相关性分析,结果发现土壤有机质、全氮和有效磷是显著影响4种植被恢复模式土壤真菌群落组成的环境因子。综上所述,在矿区生态复垦过程中刺槐模式是物种相对多度最高的植被恢复模式,油松模式是优势菌群含量最高的植被恢复模式。研究结果可为植被修复煤矿复垦区土壤及真菌资源的开发利用提供理论依据。