胰岛素作用原理的研究——Ⅰ.胰岛素及其类似物与其受体的相互作用

研究了一些胰岛素B链羧端肽段改变了的类似物与肝细胞及脂肪细胞的受体蛋白结合性质。这些结果说明,去B链羧端五肽胰岛素与胰岛素有相同的结合能力;去B链羧端六肽胰岛素及B_(23)被D-丙氨酸取代的去B链羧端六肽胰岛素有明显的结合;去B链羧端八肽胰岛素具极微的结合能力;胰岛素A链、促肾上腺皮质素、增血糖素不与胰岛素受体蛋白结合。在此基础上还讨论了B_(24)芳香环参与胰岛素结合部位的可能性,并假设B_(12),B_(16),B_(24),B_(25)疏水平面可能是结合部位的重要内容。而B_(20)～B_(23)U形转折及A_(21)…B_(22)盐键的作用是稳定疏水平面结构。胰岛素与受体的结合类似于胰岛素二体中两个单体的结合。     

B27K—去B链C端三肽胰岛素的制备、生物活力与自聚合性质

液相合成五肽Gly Phe Phe Tyr Lys(Boc)Obut,与B链C端去八肽胰岛素酶促缩合得到B2 7K 去B链C端三肽胰岛素(B2 7K DTrI,B2 7K destripeptideinsulin)。用小鼠惊厥法和小鼠降血糖法测得B2 7K DTrI的整体生物活力为标准胰岛素的 80 % ,B2 7K DTrI与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合能力为标准胰岛素的 ( 12 5± 13 ) %。用凝胶过滤法证明B2 7K DTrI自聚合性质降低 ,具有与去B链C端五肽胰岛素相同的单体性质。在B2 7K DtrI结构中 ,B2 7T被K取代 ,其优点是在酵母中表达其前体后 ,可以很方便地通过胰蛋白酶水解获得     

抗肿瘤血管三结构域单链抗体VH/L的构建与表达

以本室研制的一株抗肿瘤血管单克隆抗体AA98为基础,采用PCR扩增抗体AA98基因的重链可变区(V_H)和轻链(L),以重链恒定区1(C_H1)5′端12个氨基酸的序列作为连接肽,并将连接肽中的Lys突变为Ser,构建VH连接肽-L三结构域单链抗体。重组VH/L单链抗体在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占菌体总蛋白质的20%。表达的蛋白质在菌内形成包含体,经凝胶过滤法复性,获得了有抗原结合活性的V_H/L。该三结构域单链抗体的成功构建和复性,为重组抗体片段的研制提供了借鉴。     

人胰岛素突变体的分离纯化及性质研究

将人胰岛素原突变体(A4Glu→Leu)基因重组到pBV220表达载体上,在E.coli系统中得到高效表达,表达产物经SephadexG-50柱层析分离以及胰蛋白酶和羧肽酶B的酶促转化等步骤,可得到纯的人胰岛素突变体(A4Glu→Leu),其氨基酸组成与预期值相符,其受体结合活性及生物活性与标准猪胰岛素的基本相同.     

[A6-Ala,A11-Ala]-人胰岛素突变体的构建及其生物活性

利用 PCR技术 ,将胰岛素原基因中 A6和 A1 1的 Cys序列突变成 Ala序列 ,以去除 A链的链内二硫键 .突变基因连接到质粒 p BV2 2 0 ,构建了表达质粒 p JG40 3,并且在大肠肝菌中得到表达 .经过 Sephadex G- 50层析可得到纯化的突变人胰岛素原 ( Mut- HPI- Ala) .纯化产物用胰蛋白酶和羧肽酶处理 ,并经 Resource Q阴离子交换柱层析可进一步获得纯化的突变人胰岛素 ( Mut- HI- Ala) .Native- PAGE分析表明 Mut- HI- Ala的结构松散 .Mut- HPI- Ala的放射免疫活性和胰岛素受体结合活性是非突变人胰岛素原 ( Met- HPI)的 4.6%和 2 .4% .Mut- HI- Ala的放射免疫活性和胰岛素受体结合活性是非突变人胰岛素 ( Met- HI)的 4.3%和 4.6% .实验结果表明 ,胰岛素 A链内的二硫键对胰岛素的生物活性起着重要的作用     

去B链羧端七肽人胰岛素的分离纯化及性质研究

在大肠杆菌温度诱导体系中以非融合方式进行去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原基因的表达,获得去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原,表达产物占细胞总蛋白量的１３％,表达产物经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离及胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ的酶促转化等步骤,可得到纯度达９４％以上的去Ｂ链羧端七肽人胰岛素,其氨基酸组成与预期值相符,受体活性是标准猪胰岛素的１％．     

文昌鱼胰岛素样肽的表达、纯化、鉴定及其多克隆抗体制备

为了深入研究胰岛素和胰岛素样生长因子1（IGF－1）的起源和进化以及结构与功能的关系。表达了胰岛素和IGF－1的祖先分子－－文昌鱼胰岛素样肽（ILP）。重组单链ILP的基因用化学方法合成（从cDNA推测的ILPB结构域的C端和A结构域的N端用Ala-Ala-Lys三肽连接起来,并钭B28Arg突变为Lys）,克隆到表达载体pVT102-U中,ILP在酿酒酵母中得到有效表达。发酵液经4步分离纯化,得到均一的单链ILP,经质谱测定分子量和氨基酸组成分析证明表达产物正确。通过Lys-C蛋白内切酶处理将重组单链ILP转化成双链形式。虽然双链ILP与人胰岛素受体没有结合活力。但圆二色性光谱显示它与胰岛素的结构非常相似,用表达的单链ILP免疫新西兰大白兔,获得了高滴度的多克隆抗体。     

去B链羧端三肽人胰岛素的分离纯化及其性质研究

将去Ｂ链羧端三肽人胰岛素原基因克隆到表达质粒ｐＢＶ２２０上,在大肠杆菌系统中经温度诱导表达,表达产物占细胞总蛋白量的１２％,表达产物经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离以及胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ的酶促转化等步骤,可得到去Ｂ链羧端三肽人胰岛素,其纯度达９３％,其氨基酸组成与预期值相符,但其受体结合活性仅是标准猪胰岛素的４５％．     

双链杂交分子“胰岛素－类胰岛素生长因子－I

以去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素（ＤＯＩ）和化学合成的ＩＧＦ－Ｉ的２２～２９（８肽）及２２－３２（１１肽）为底物,用酶促半合成方法制备了杂交分子“胰岛素－类胰岛素生长因子－Ｉ,Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ（８）和Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ（１１）。研究了它们的胰岛素生物活性,结果表明,猪胰岛素Ｂ链Ｃ端Ｂ２７的Ｔｈｒ被Ａｓｎ取代,Ｂ３０的Ａｌａ被Ｔｈｒ取代同时Ｂ２５～Ｂ２６及Ｂ２８－Ｂ２ｋ９氨基酸顺序颠倒以及在Ｂ链Ｃ末端延长３肽（Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ）都不影响胰岛素的生物活力。     

胰岛素蛋白质工程：高活性［B10Asp］人胰岛素

用基因定位突变方法将胰岛素Ｂ链第１０位的Ｈｉｓ变为Ａｓｐ,获得高活力胰岛素──［Ｂ１０Ａｓｐ］人胰岛素。其受体结合能力和离体生物活力分别为猪胰岛素的２６２％和２３５％;体内生物活力也明显高于猪胰岛素;它的促细胞生长能力为猪胰岛素的１７４％。     

双链杂交分子“胰岛素—类胰岛素生长因子—I”

以去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素和化学合成的ＩＧＦ－Ｉ的２２－２９及２２－３２为底物,用酶促半合成方法制备了杂交分子“胰岛素－类胰岛素茵子－Ｉ”,Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ和Ｉｎｓ－ＩＧＦ－Ｉ。研究了它们的胰岛中生物活性。结果表明,猪胰岛素Ｂ链Ｃ端Ｂ２７的Ｔｈｒ被Ａｓｎ取代,Ｂ３０的Ａｌａ被Ａｌａ被Ｔｈｒ取代同时Ｂ２５－Ｂ２６及Ｂ２８－Ｂ２９氨基酸顺序颠紧及在Ｂ链Ｃ末端延长３肽都不影响胰岛素的生物活力。     

胰岛素蛋白质工程：高活性（B10Asp）人胰岛素

用基因定位突变方法将胰岛素Ｂ链第１０位的Ｈｉｓ变为Ａｓｐ,获得高活力胰岛素（Ｂ１０Ａｓｐ）人胰岛素,其受体结合能力和离体生物少分别为猪胰岛素的２６２％和２３５％体内生物活力也明显高于猪胰岛素,它的促细胞生长能力为猪胰岛素的１７４％。     

胰岛素B链C端及B29Lys氨基在胰岛素促生长功能中的 …

利用结晶紫测定细胞生长的方法,在９６孔板培养的小鼠乳腺癌细胞ＧＲ２Ｈ６中,建立了胰岛素促细胞生长活力的测定体系。该方法具有灵敏度高,重复性好,操作简便,周期短及便于大量样品分析测试的优点。利用该方法研究了胰岛素Ｂ链Ｃ端延长与缩短的类似物和胰岛素侧链氨基对胰岛素促生长活性的影响。结果显示,胰岛素Ｂ链Ｃ端在胰岛素的促生长活性中有重要作用;Ｂ链２９Ｌｙｓ氨基对促生长活性也有较大贡献。     

GABA/孕酮激发豚鼠精子聚磷酸肌醇降解及其在顶体反应中的作用

为了研究GABA/孕酮(P₄)激发精子聚磷酸肌醇(PPI)降解及其在顶体反应(AR)中的作用,将豚鼠精子在MCM培养基获能培养5.5 h,³²P-标记精子1h,经Percoll密度梯度离心洗涤,然后以AR刺激剂激发精子AR,并对精子膜脂进行提取、分离和鉴定,同时,以相差显微镜评价精子AR%.结果为:(i)GABA刺激二磷酸磷脂酰肌醇(PIP₂)和一磷酸磷脂酰肌醇(PIP)迅速降解,而磷脂酸(PA)增加;在5min时PIP₂和PIP明显下降,10min几近完成,而AR明显滞后,15min才达到峰值;(ii)A23187,P₄和GABA均可激发PPI降解和AR增加,其能力依次为A23187＞P₄≥GABA;(iii)新霉素可明显地抑制Ca²⁺/GABA 或P₄及A23187刺激PIP₂和PIP降解、PA产生和AR增加;(iv)PPI降解需Ca²⁺参与.当EGTA或Ca²⁺通道阻滞剂(La³⁺)存在时,PIP₂和PIP降解,PA产生和AR升高均被明显抑制.上述结果表明,天然激动剂GABA或P₄刺激豚鼠精子膜PPI降解是引起AR的基础,该作用是通过Ca²⁺介导、激活膜磷脂酰肌醇特异磷脂酶C(PIC)而完成的.     

胰岛素片段与胰岛素抗体的相互作用

本文研究了若干胰岛素片段及去B链C端八肽胰岛素(DOI)、A链、B链与胰岛素抗体的结合能力。结果表明N 端区域片段保留部分胰岛素的免疫活力,而C 端片段除“工”字肽的免疫活力比A 链略高外,其他片段(B_(26～30),B_(22～26))均和A 链类似,没有胰岛素的免疫活力。以上结果进一步说明在免疫活力方面,胰岛素分子的N 端区域比C 端重要。同样,B 链可能比A 链重要。     

胰岛素B链C端及B29Lys氨基在胰岛素促生长功能中的作用

利用结晶紫测定细胞生长的方法,在９６孔板培养的小鼠乳腺癌细胞ＧＲ２Ｈ６中,建立了胰岛素促细胞生长活力的测定体系。该方法具有灵敏度高,重复性好,操作简便,周期短及便于大量样品分析测试的优点。利用该方法研究了胰岛素Ｂ链Ｃ端延长与缩短的类似物和胰岛素侧链氨基对胰岛素促生长活性的影响。结果显示,胰岛素Ｂ链Ｃ端在胰岛素的促生长活性中有重要作用;Ｂ链２９Ｌｙｓ氨基对促生长活性也有较大贡献。     

胰岛素片段与胰岛素抗体的相互作用

本文研究了若干胰岛素片段及去B链C端八肽胰岛素(DOI)、A链、B链与胰岛素抗体的结合能力。结果表明N端区域片段保留部分胰岛素的免疫活力,而C端片段除“工”字肽的免疫活力比A链略高外,其他片段(B_(26～30),B_(22～26))均和A链类似,没有胰岛素的免疫活力。以上结果进一步说明在免疫活力方面,胰岛素分子的N端区域比C端重要。同样,B链可能比A链重要。     

噬菌体434单链阻遏蛋白高亲和力DNA配体的筛选和设计

单链阻遏蛋白R R_TRES是噬菌体434阻遏蛋白的衍生物,含有两个DBD(DNA结合结构域),一个是野生型噬菌体434的DBD-R,另一个是突变型DBD-R_TRES,二者用重组接头以头接尾的方式连接起来.R_TRES的α-3-螺旋中-1,1,2,5位DNA结合氨基酸分别为T,R,E,S. 利用核心序列是CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG的随机DNA库, 体外循环筛选R_TRES的DNA结合位点,将筛选到的群体克隆、测序.单链阻遏蛋白RR_TRES的亲和力测定表明,最适操纵区序列含有TTAC或TTCC(上述画线部分)时,K_d值在10^-12~10^-11mol/L的范围.天然噬菌体434阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的K_d值在10^-9 mol/L数量级,与之相比,所筛选操纵区的亲和力明显提高.同时发现,亲和力大小还受到最适结合位点两侧碱基的影响,特别是5′位碱基的影响.根据R_TRES的识别特性,设计了共有序列为GTAAGAAARNTTACN或GGAAGAAARNTTCCN (R为A或G)的单链阻遏蛋白R_TRES R_TRE的操纵区序列.结果表明,它们之间有特异性结合,且亲和力也很高.此方法可望用于其他DNA结合蛋白新的结合特异性的筛选.     

〔B25－Trp〕去B链C端五肽胰岛素酰胺的合成及性质

去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素（ＤＯＩ）与Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－ＮＨ２通过胰蛋白酶催化缩合后,经分离纯化得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的Ｂ２５－Ｔｒｐ取代的去Ｂ链Ｃ端五肽胰岛素酰胺（〔Ｂ２５－Ｔｒｙ〕ＤＰＩ－ＮＨ２）．酶促缩合率大于８５％,回收率为３６．２％。用小白鼠惊厥法测得〔Ｂ２５－Ｔｒｐ〕ＤＰＩ－ＮＨ２的体内活力约为天然胰岛素的７０％,用人胎盘细胞膜测得的其胰岛素受体结合能力为天然胰岛素的７２．５±２．４％;利用色氨酸和酪氨酸的内源荧光研究了此类似物的溶液构象．     

胰岛素的促生长作用

除了经典的代谢调节作用之外,胰岛素还具有重要的促生长作用：在体外胰岛素能够刺激众多细胞的增殖与分化,一些实验证明胰岛素在体内可能也是一种重要的生长调节因子.胰岛素的促生长作用通过细胞表面的胰岛素受体介导,但在较高的胰岛素浓度下也可以通过类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)受体进行,在不同细胞体系中可能会有所不同.受体后的信号转导经过了一系列磷酸化和去磷酸化等途径,其中有胰岛素受体底物1(IRS-1)、Shc蛋白、Ras蛋白以及磷酸肌醇3激酶(PI3-K)等的参与.在胰岛素的分子表面很可能存在一些区域或位点,对其促生长作用有着更大的贡献,通过对一些高促生长活性的胰岛素类似物的研究已揭示出一些初步的证据.