2株WU多瘤病毒全基因组序列测定和分析

WU多瘤病毒(WUPyV)是多瘤病毒科多瘤病毒属的新成员,近来发现与人呼吸道感染等有关。本研究对2株WUPyV进行全基因组序列测定和拼接,获得这2株病毒全基因组序列,并与已上传到GenBank的国内外几株WUPyV的全基因组序列和氨基酸序列进行比对和系统进化分析。这2株WUPyV是环状、双链DNA病毒,基因组全长5 228bp,比GenBank已知WUPyV全序列少1bp。缺失的一对碱基位于位点4 536处,属于大T抗原的非编码区。病毒全基因组编码5个蛋白,分别是3个衣壳蛋白VP2、VP3、VP1与大T抗原和小T抗原。系统进化分析显示相对中国福建福州的FZ18株,另一株FZTF株与参考株-澳大利亚的B0株关系较近。     

人博卡病毒基因克隆及衣壳编码基因序列变异分析

为了解人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)VP1基因进化关系;阐明HBoV目前具体的变化规律,用PCR的方法扩增了1株HBoV的全基因和9株HBoV的VP1基因,克隆并测序,在此基础上,将HBoV的全基因序列和衣壳序列分别与细小病毒亚科其他14个有代表性的病毒进行遗传分析,构建进化树,对目前所有可得到的HBoV的17个衣壳蛋白进行二级结构分析和抗原性分析。结果显示:HBoV全基因序列与B19关系较远,但衣壳序列遗传关系较近。以有典型性的猫瘟细小病毒(Feline parvovirus,FPV)衣壳蛋白为参照,分析多个HBoV衣壳序列之间的变异情况,显示HBoV衣壳的二级结构基础表现出较高的保守性,序列之间的变化主要发生在高抗原区域和感染活性区域。衣壳病毒变异情况显示HBoV在稳定自身的情况下表现出一定的活跃性以逃避免疫反应,也表现出一定的感染适应力。     

北京地区人偏肺病毒膜表面糖蛋白G编码基因和特征的分析

为了解北京地区人偏肺病毒(hMPV)膜表面糖蛋白G编码基因的特征,提取2003年和2004年各6份hMPV阳性的临床呼吸道标本中的RNA,经用随机引物合成cDNA后,用特异性引物扩增G蛋白全基因,克隆至pBS-T载体中并进行测序。用生物软件与GenBank中hMPV的基因序列进行比较和种系进化分析。12株hMPV可以分为两个主要的进化簇1和2。每个进化簇还可以再分为不同的亚进化簇。3株(2003年)hMPV属于进化簇1;9株(3株2003年和6株2004年)hMPV属于进化簇2。这12株hMPV G蛋白基因的核苷酸长度在624~711nt,使用了两种不同的终止密码,编码的氨基酸长度为208~236 aa,蛋白质分子量为22.9~25.8kD。与进化簇2相比,进化簇1的3株hMPV都出现了3个核苷酸的缺失,但未改变读码框架。同一进化簇内的hMPV G蛋白基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.7%~100%和91.8%~100%,不同进化簇间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为56.3%~57.4%和34.3%~38.2%。疏水性分析表明这12株hMPV G蛋白是典型的Ⅱ型跨膜锚定蛋白,分别与两个进化簇代表株的疏水图一致。这些hMPV的G蛋白氨基酸的替换集中在胞外区。它们都含有高百分比的脯氨酸(P)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T),含有相当数量的位于胞外区的O-连接糖基化位点。这些hMPV的G蛋白的N-连接糖基化位点数目和位置不尽相同。通过对G蛋白基因的分析显示,2003年和2004年北京地区流行的hMPV分属于两种不同的进化簇。基因分析显示hMPV的G蛋白是高糖基化的膜表面蛋白,具有与同属于副粘病毒科、肺病毒亚科的人呼吸道合胞病毒(hRSV)的G蛋白相似的基因特征,推测其功能和在感染免疫中的作用相当于hRSV的G蛋白,但有待进一步深入研究予以证实。     

霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列的测定与分析

测定并分析了霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列,为VP2生物学特性和功能研究提供分子遗传学基础。为此构建了VP2DNA随机文库,鸟枪法(shot-gun)测定其全基因组序列。测序结果用软件Phrad-Prap拼接成最小重叠群(contig),引物步移法测定contigs问的缝隙(gap)序列,拼接后获得VP2全基因组序列。利用生物信息学技术分析’VP2基因组,最后对VP2和相关噬菌体做DNA聚合酶(DNA pol)基因的进化树分析。结果：VP2属短尾噬菌体科,基因组全长39853bp,为环状双链DNA,G C含量为50．56％,较高于霍乱弧菌测序菌株N16961基因组G C含量;VP2的基因组有碱基使用偏性;预测和注释了45个开放读码框(ORF),分析了DNA复制基因、衣壳蛋白和DNA包装基因、侵染相关基因。DNA pol进化树比较结果,VP2与链球菌噬菌体Cp-1和芽孢杆菌噬菌体GA-1分为一群。根据对VP2基因组序列的测定和分析预测了VP2的ORF,并分析了其中的功能基因,推测VP2在进化关系上属于噬菌体phi29样噬菌体。     

家蚕传染性软化病病毒（桐乡株）VP1基因片段的克隆及序列分析

以首株在中国分离到的家蚕传染性软化病病毒（Bombyx mori infectious flacherie virus,BmIFV）BmIFV-CHN001基因组为模板,扩增了编码主要结构蛋白的VP1基因。克隆测序后得到VP1基因片段906 bp。该序列与已发表的日本毒株相比,核苷酸序列的相似性为99.3%,编码氨基酸的相似性为100%,证明该毒株与家蚕传染性软化病病毒日本株的同源性较高。把BmIFV-CHN001的VP1序列与同属的另外6个昆虫小RNA病毒的结构蛋白进行序列比对,构建系统发育树,对其进化关系进行了初步分析,结果显示这7种病毒具有相近的亲缘关系,而BmIFV-CHN001与蜜蜂囊雏病毒的亲缘关系最近。     

我国蚊虫分离的一种新型胞质多形体病毒

0507BS3是从中国新疆喀什地区采集的库蚊和按蚊混合蚊标本分离的病毒株,对C6/36细胞致病变而对Ve-ro和BHK-21细胞不致病变。电镜观察显示病毒颗粒呈圆球形,直径约60nm(n=20),无包膜,单层衣壳,衣壳内有中央核。基因组核酸电泳显示基因组包括10条双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)片段。病毒第10基因片段核酸序列测定显示该片段全长964bp(GenBankID:FJ150869),具有单一开放读码框,编码长度为275个氨基酸的蛋白,分子量约30.8kD。病毒第10基因片段核酸序列比对未发现相似的病毒核酸序列,氨基酸序列与胞质多形体病毒(Cytoplasmic polyhedrosis virus,CPV)第10基因片段编码的多形体蛋白部分区段匹配。病毒第10基因片段和已知各型CPV第10基因片段核酸序列共同进行系统进化分析显示该病毒位于独立的进化分枝,提示0507BS3病毒可能是一种新型CPV病毒。     

新成人腹泻轮状病毒J19株VP2、VP3的编码基因序列分析

利用一种改良的非依赖核酸序列的单引物扩增方法,从新成人腹泻轮状病毒J19株的核酸中扩增基因,克隆至pMD18-T中并进行测序和基因序列分析。J19株的VP2、VP3的编码基因为基因2、4,分别长2 969bp、2 204bp,它们分别编码973个氨基酸和719个氨基酸。J19株的VP2蛋白序列对B组人轮状病毒IDIR株的一致性为47.2%;J19株的VP3蛋白序列对C组人轮状病毒Cowden株一致性为25.1%。对J19株VP2的遗传进化分析表明,J19株在进化树上的位置靠近外群蛋白以及A、B和C组轮状病毒分枝的根部,并且它比较偏向于B组轮状病毒的分枝。这与VP6的遗传进化分析结果相一致。根据上述结果推测J19株可能是一个与B组轮状病毒的起源和进化密切相关的毒株之一;同时,这表明VP2在研究轮状病毒的遗传进化上具有重要价值。关于新成人腹泻轮状病毒J19株VP2、VP3的编码基因的序列分析,这是首次报道。     

圆环病毒Cap基因及其编码的衣壳蛋白研究进展

圆环病毒负义链上的Cap基因是基因组中变化最大的基因,其编码病毒的衣壳蛋白,具有良好的免疫原性,N端的核定位信号与病毒的定位有关。本文对圆环病毒Cap基因的序列特点、编码衣壳蛋白氨基酸序列的特点、基本功能、在病毒复制、运输中的作用以及与MKRN1蛋白、热激蛋白Hsp40、受体蛋白gC1qR、补体因子C1qB的相互作用进行了总结,旨在阐明衣壳蛋白在病毒吸附、复制以及运输中发挥着重要作用,为今后深入研究提供重要的理论依据。     

2007―2008年肠道病毒71型北京地区分离株的VP4基因序列分析

为了解2007 ― 2008 年北京地区流行的肠道病毒71 型( EV71) 是否存在基因序列变异及其与病毒毒力的关系, 我们选择2007 年分离的3 株EV71( 其中1 株分离自重症手足口病患儿的咽拭子标本, 其余2 株分离自普通手足口病患儿咽拭子标本) 和2008 年分离的5 株EV71( 其中3 株分离自重症手足口病患儿的咽拭子或鼻拭子标本, 2 株分离自普通手足口病患儿的疱疹液标本) , 提取基因组RNA, 经反转录-聚合酶链反应( RT-PCR) 扩增得到VP4 基因片段, 并进行核苷酸序列测定, 使用生物信息软件与GenBank 中的EV71 VP4 基因进行序列及病毒型别分析。结果表明, 所测得的8 株EV71 VP4 基因全长均为207 bp, 编码69 个氨基酸, 理论相对分子质量( Mr) 为7 ×10³。8 株EV71 病毒VP4 基因的核苷酸同源性在94% ～100% , 与GenBank 中其他EV71 病毒株VP4 的核苷酸同源性为82% ～100% , 与阜阳、深圳和台湾等地区流行的EV71 VP4 的核苷酸同源性比其他地区高。除了与印度报道的VP4 编码的氨基酸在第7 和54 位不同外( 印度株: 7 位蛋氨酸, 54位苏氨酸; 其余株7 位苏氨酸,54 位丙氨酸) , 这8 株EV71 VP4 编码的氨基酸序列之间以及与其他EV71 VP4编码的氨基酸同源性均为100%。8 株EV71 病毒VP4 与文献报道的3 株重症感染病毒株VP4 ( BrCr、MS 和NCKU9822) 核苷酸有较大差别, 而8 株病毒株中从重症感染( BJ97、BJ110B、BJ110Y 和BJ4243) 与轻症感染( BJ25、BJ47、BJ65 和BJ67) 分离到的毒株之间VP4 基因序列未见明显改变, 只有几个核苷酸存在差别。VP4 核苷酸序列的进化树分析表明, 这8 株EV71 均属于C4 亚型, 显示2007 ― 2008 年北京地区流行的EV71的VP4 基因相当保守, 分离自伴有神经系统感染的重症手足口病和普通手足口病患儿的EV71 的VP4 基因之间在核苷酸水平未出现同样的变异。结果提示, 近2 年来北京地区所流行的EV71 属C4 亚型。     

一株辛德毕斯病毒的基因组序列测定及分析

目的：对引进的一株辛德毕斯病毒的基因组序列进行测定,阐明其与已报道毒株序列的关系。方法：对辛德毕斯病毒基因组编码区进行分段RT-PCR扩增,对非编码区采用RACE法进行扩增,将扩增产物直接进行测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列,采用MEGA3.1软件对9株辛德毕斯病毒基因组序列进行系统进化发生树的构建。结果与结论：此株辛德毕斯病毒基因组共11663nt,编码3745个氨基酸残基,其中5＇端的2/3基因组编码4种非结构蛋白NSp1、NSp2、NSp3和NSp4,3＇端的1/3基因组编码5种结构蛋白E1、E2、E3、6K和C;结构基因和非结构基因之间有48nt的连接区为非翻译区;病毒基因组5＇末端和3＇末端分别有59、318nt的非编码区;序列同源性分析结果表明,此株病毒与S.A.AR86株的同源性最高,两者核苷酸序列的同源性为99.7%,氨基酸序列的同源性为99.6%,而与本室保存的另一辛德毕斯病毒MEI株的遗传进化关系稍远,系统进化发生树处于不同分支上。     

Identification of a novel polyomavirus from patients with acute respiratory tract infections

We report the identification of a novel polyomavirus present in respiratory secretions from human patients with symptoms of acute respiratory tract infection. The virus was initially detected in a nasopharyngeal aspirate from a 3-year-old child from Australia diagnosed with pneumonia. A random library was generated from nucleic acids extracted from the nasopharyngeal aspirate and analyzed by high throughput DNA sequencing. Multiple DNA fragments were cloned that possessed limited homology to known polyomaviruses. We subsequently sequenced the entire virus genome of 5,229 bp, henceforth referred to as WU virus, and found it to have genomic features characteristic of the family Polyomaviridae. The genome was predicted to encode small T antigen, large T antigen, and three capsid proteins: VP1, VP2, and VP3. Phylogenetic analysis clearly revealed that the WU virus was divergent from all known polyomaviruses. Screening of 2,135 patients with acute respiratory tract infections in Brisbane, Queensland, Australia, and St. Louis, Missouri, United States, using WU virus-specific PCR primers resulted in the detection of 43 additional specimens that contained WU virus. The presence of multiple instances of the virus in two continents suggests that this virus is geographically widespread in the human population and raises the possibility that the WU virus may be a human pathogen.     

WU多瘤病毒在中国浙江地区的发现与鉴定

呼吸道病毒种类很多,大部分的病毒感染机体后可以导致大面积人群不同程度的发病,严重的可导致死亡[1].     

肠道病毒71型安徽、河南株的分离与VP1序列进化分析

旨在研究手足口病患者中肠道病毒71型分离株的病毒基因型特征。采集手足口病患者的粪便标本,进行病毒分离和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)特异性扩增进行鉴定,同时选取其中9株EV71分离株,对其抗原决定簇部位VP1区进行核酸序列测定,并参考EV71 A、B、C各基因型的参考株和以往中国EV71的分离株进行同源分析和构建系统发生树。结果显示,所分析的9株病毒株均为C4亚型,3株安徽株H7、H8和H9的VP1序列相似度很高(≥98.8%,其中H7、H9的相似度为100.0%),4株河南株H3、H4、H5和H6相似度较高(≥98.4%,H3、H4和H5≥99.6%,其中H3、H4的相似度为100.0%),它们同河南株H1、H5的相似度也较高(≥97.2%),河南株H2虽然与其他河南株具有较高的序列相似度,但进化分析表明,其与安徽株同源性较高。结果表明,安徽株H7、H8和H9株变异速率明显加快,这可能导致了手足口病在安徽省的率先爆发与大流行,河南株H2最初可能由安徽传入河南。     

Feline calicivirus VP2 is essential for the production of infectious virions

The third open reading frame (ORF3) located at the 3′ end of the genomic RNA of feline calicivirus (FCV) encodes a small (12.2-kDa) minor structural protein of 106 amino acids designated VP2. Point mutations and deletions were introduced into an infectious FCV cDNA clone in order to evaluate the functional importance of ORF3 and its encoded protein, VP2. Deletion of the entire ORF3 sequence was lethal for the virus, and evidence was found for strong selective pressure to produce the VP2 protein. Extended deletions in the 5′ end and small deletions in the 3′ end of ORF3, as well as the introduction of stop codons into the ORF3 sequence, were tolerated by the viral replication machinery, but infectious virus could not be recovered. Infectious virus particles could be rescued from a full-length FCV cDNA clone encoding a nonfunctional VP2 when VP2 was provided in trans from a eukaryotic expression plasmid. Our data indicate that VP2, a protein apparently unique to the caliciviruses, is essential for productive replication that results in the synthesis and maturation of infectious virions and that the ORF3 nucleotide sequence itself overlaps a cis-acting RNA signal at the genomic 3′ end.     

传染性法氏囊病毒的抗原及分子特征

用鸡胚成纤维细胞对来自野外的 5 个传染性法氏囊病毒株 (IBDV-JD1 、 JD2 、 NB 、 HZ1 、 HZ2) 进行分离,测定理化特性、致病性,同时进行血清亚型测定及 A 片段基因组的克隆分析 . 试验所用 5 个法氏囊组织悬液在鸡胚成纤维细胞盲传 2~14 代后适应细胞并产生细胞病变 . 细胞适应的 IBDV 毒株的理化和形态特征与经典传染性法氏囊病毒株一致 . 除 IBDV-HZ1 、 HZ2 属经典 IBDV 血清型外, IBDV-JD1 、 JD2 和 NB 毒株分属不同的血清亚型 . 人工感染实验结果显示,分离的 IBDV 毒株产生与野外病例相似的临床症状和病变,出现法氏囊滤泡髓质的淋巴细胞变性、坏死和消失 . 基因组序列分析显示, IBDV-NB 毒株 A 片段由 3 264 个核苷酸组成,编码由 145 个氨基酸残基组成的 VP5 和由 1 012 个氨基酸残基组成的多聚蛋白 . 与来自 GenBank 的 IBDV Ⅰ型毒株比较, NB 毒株 A 片段编码的多聚蛋白与 JD1 毒株的同源性最高,达 99.5% , VP2 与 JD1 、 CEF94 、 D78 的同源性为 99.8% , VP3 与 JD1 的同源性为 99.2% , VP4 与 JD1 的同源性为 100% , VP5 与 JD1 , HZ2 , P2 , CEF94 , CT , Cu-1 和 D78 毒株的同源性为 99.3%. NB 毒株 VP2 蛋白的第 253 、 280 、 284 位氨基酸残基与 IBDV 变异毒株和经典毒株一致,但不同于 IBDV 超强毒株 . 这些结果暗示 IBDV 的抗原表位是构象依赖性表位, IBDV 血清亚型的形成与 IBDV 弱毒疫苗病毒株密切相关 .     

一株鸡传染性贫血病毒野毒株致病性及其全基因组序列比较

从山东某商品代肉鸡场表现生长迟缓的14日龄病鸡群分离到一株鸡传染性贫血病毒(CAV)C14株。C14株感染1日龄SPF鸡能抑制对禽流感病毒(AIV)的抗体反应,还能与禽网状内皮增生病病毒(REV)在免疫抑制上起协同作用。用PCR方法分段扩增出C14基因组的三条部分重叠片段,分别克隆于T载体并进行测序,拼接后得到其全基因组序列。测序结果表明,CAV-C14株基因组全长2298bp,含有3个互相重叠的开放阅读框和1个调控区。将C14与国内外已发表的CAV参考株基因组比较,同源性为97.2%~99.2%。序列比较表明CAV非编码区中含有的多个与复制及转录调控相关已知基序的序列都非常保守。CAV的3个编码基因VP1、VP2和VP3均有一定程度变异,以VP1变异性最大,且不同毒株间的3个蛋白质氨基酸序列的变异是互不相关的。     

口蹄疫病毒Asia1/YNBS/58株全基因组序列分析

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth dis-ease virus,FMDV)感染引起的偶蹄动物(猪、牛、羊、骆驼等)共患的一种急性、烈性、接触性传染病。FMDV是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员,有7个血清型,分别为O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3,完整     

Construction of recombinant DNA molecules by the use of a single stranded DNA generated by the polymerase chain reaction: its application to chimeric hepatitis A virus/poliovirus subgenomic cDNA.

In order to study the importance of VP4 in picornavirus replication and translation, we replaced the hepatitis A virus (HAV) VP4 with the poliovirus (PV1) VP4. Using a modification of oligonucleotide site directed mutagenesis and the polymerase chain reaction (PCR), we created a subgenomic cDNA chimera of hepatitis A virus in which the precise sequences coding for HAV VP4 capsid protein were replaced by the sequences coding for the poliovirus VP4 capsid protein. The method involved the use of PCR primers corresponding to the 3' and 5' ends of the poliovirus VP4 sequence and that had HAV VP4 3' and 5' flanking sequences on their 5'ends. Single stranded DNA of 240 and 242 nt containing the 204 nt coding for the complete poliovirus VP4 were produced by using a limiting amount of one of the primers in a PCR reaction. These single stranded PCR products were used like mutagenic oligonucleotides on a single stranded phagemid containing the first 2070 bases of the HAV genome. Using this technique, we precisely replaced the HAV VP4 gene by the poliovirus VP4 gene as determined by DNA sequencing. The cDNA was transcribed into RNA and translated in vitro. The resulting protein could be precipitated by antibody to poliovirus VP4 but not to HAV VP4.     

Antigenic and genetic variation in cytopathic hepatitis A virus variants arising during persistent infection: evidence for genetic recombination.

Variants of hepatitis A virus (pHM175 virus) recovered from persistently infected green monkey kidney (BS-C-1) cells induced a cytopathic effect during serial passage in BS-C-1 or fetal rhesus kidney (FRhK-4) cells. Epitope-specific radioimmunofocus assays showed that this virus comprised two virion populations, one with altered antigenicity including neutralization resistance to monoclonal antibody K24F2, and the other with normal antigenic characteristics. Replication of the antigenic variant was favored over that of virus with the normal antigenic phenotype during persistent infection, while virus with the normal antigenic phenotype was selected during serial passage. Viruses of each type were clonally isolated; both were cytopathic in cell cultures and displayed a rapid replication phenotype when compared with the noncytopathic passage 16 (p16) HM175 virus which was used to establish the original persistent infection. The two cytopathic virus clones contained 31 and 34 nucleotide changes from the sequence of p16 HM175. Both shared a common 5' sequence (bases 30 to 1677), as well as sequence identity in the P2-P3 region (bases 3249 to 5303 and 6462 to 6781) and 3' terminus (bases 7272 to 7478). VP3, VP1, and 3Cpro contained different mutations in the two virus clones, with amino acid substitutions at residues 70 of VP3 and 197 and 276 of VP1 of the antigenic variant. These capsid mutations did not affect virion thermal stability. A comparison of the nearly complete genomic sequences of three clonally isolated cytopathic variants was suggestive of genetic recombination between these viruses during persistent infection and indicated that mutations in both 5' and 3' nontranslated regions and in the nonstructural proteins 2A, 2B, 2C, 3A, and 3Dpol may be related to the cytopathic phenotype.