新型α-半乳糖苷酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的：制备高效价、高特异性的新型α-半乳糖苷酶的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法：用脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶（纯度大于90％）免疫新西兰大白兔,获得α-半乳糖苷酶的兔抗血清,并经HiTrap rProteinA柱纯化获得高纯度的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹评价抗体的特异性。结果：通过免疫法得到了α-半乳糖苷酶的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1：1×10^6,经rProteinA柱纯化后获得了高效价、高纯度的抗体,Western印迹显示该抗体特异性地与新型α-半乳糖苷酶结合。结论：获得了新型α-半乳糖苷酶的高效价、高特异性的兔多克隆抗体,可用于血型转变过程中残留α-半乳糖苷酶含量的特异性检测。     

作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶(EmGalase)的鉴定和研究

对脑膜炎败血伊丽莎白金菌进行糖苷酶功能基因组分析发现,该菌存在一个GH27家族α-半乳糖苷酶基因。克隆该基因并表达蛋白后,利用人工合成的pNP底物研究其酶学性质,发现该酶具有α连接的半乳糖(α-galactose,α-Gal)底物特异性,酶反应pH为3.0~8.0,反应温度为4~45 ℃。用不同寡糖底物进一步确定,该酶能够酶切直链末端α-1,3、1,4、1,6Gal。在猪红细胞上进行的酶切实验显示,该酶能够高效清除存在于猪红细胞表面的末端Gal α 1-3Gal表位。末端α-半乳糖基化修饰在免疫与感染中发挥着重要的生物学作用,作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶的发现将为该领域的研究提供一个新的工具,为缓解异种输血中的超急性免疫排斥反应提供一种可能。     

一种来源于脆弱类杆菌的α-半乳糖苷酶的理化性质及其酶解B型红细胞的工艺研究

利用α-半乳糖苷酶去除红细胞表面的B抗原是制备通用O型红细胞的有效方法.本文在克隆表达纯化脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶的基础上对其理化性质进行了研究,该酶的分子量为64908Da,等电点在7.12～7.30之间,最适温度为41℃,最适pH为5.6～6.0,其理化性质适合用于B型红细胞的血型改造;为了确定高效、快速、温和的酶解条件,本文对酶解B型红细胞的工艺进行了优化.通过研究缓冲液对酶与红细胞结合的影响,确定了最佳酶解缓冲液为250mmol/L甘氨酸和3mmol/LNaCl,pH6.8;酶解的最适红细胞压积为40%,酶解温度为26℃,酶解时间为1h.利用优化的酶解工艺获得的B-ECORBCs形态及结构功能指标均正常,流式细胞结果证明其B抗原和H抗原标记率与O型红细胞相当,说明制备B-ECORBCs的工艺已成熟.这种工艺具有酶用量少、酶解条件温和、制备过程简单和时间短等优势,具有很好的临床应用前景.     

新型基因重组α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性研究

观察脆弱类杆菌来源的新型重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株的遗传稳定性.在有选择压力(Kan+)条件下,将重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗性、平板传代及诱导过程中的质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力检测.结果表明细菌形态、生长速度和抗生素抗性等与原始种子库无明显差异;LB固体培养基上传60代后质粒稳定性接近100％,但诱导过程中质粒易丢失.第20、40和60代提取质粒进行酶切检查,酶切图谱没有改变.DNA测序未见α-半乳糖苷酶基因变异.原代菌株及第20、40和60代菌株经诱导培养,其α-半乳糖苷酶表达水平、酶活力及菌体蛋白的SDS-PAGE图谱均无明显差异.说明α-半乳糖苷酶工程菌株在平板传代中具有良好的遗传稳定性     

五指山小型猪单个核细胞表面α Gal抗原表达差异的分析

利用猪的器官为挽救脏器终末衰竭病人而进行的异种移植是有效救治病人的途径之一.由于猪细胞表面存在的α1,3半乳糖会引起超急性免疫排斥反应,导致移植器官最终被移植受体排斥.除人类和旧大陆猴外,所有哺乳动物细胞表面都有αGal半乳糖表达,但个体间表达量存在显著差异.为研究近交系五指山小型猪细胞表面α1,3半乳糖表达的个体差异,本实验利用FITC-isolectin进行荧光标记,通过流式细胞术以及激光共聚焦分析,对14例5月龄猪样本外周血单个核细胞表面的α1,3半乳糖水平进行检测.利用猪肾上皮PK15细胞确定FITC-isolectin标记的最适浓度为25ng/μl(细胞标记效率大于85%).结果显示,14头猪外周血单个核细胞表面α1,3半乳糖的表达差异范围在1.25～2.09倍之间,远低于普通非近交系猪的个体差异.本研究为利用近交系五指山小型猪作为异种器官移植的研究材料提供了基础数据.     

微生物源α-半乳糖苷酶的研究进展

介绍了微生物源α-半乳糖苷酶的生理生化特性、合成调控机制的研究进展情况及其在食品、饲料、医药工业等领域的一些应用。Α-半乳糖苷酶均是糖蛋白,不同来源的α-半乳糖苷酶的作用基质特异性差别较大,作用基质特异性差别是由蛋白质部分N-末端氨基酸序列决定的。不同微生物来源的α-半乳糖苷酶其最佳作用条件、pH稳定性及耐热性差异较大。微生物α-半乳糖苷酶是一种诱导酶,其合成受多个基因的调控,高浓度的葡萄糖能抑制其合成。     

流式细胞分析测定猪外周血单个核细胞Gal α1,3 Gal水平(英文)

在考虑以猪器官作为供体对人进行异种器官移植时,α1,3半乳糖被认为是引起超急性免疫排斥的主要异种抗原.人们建立了各种方法以降低猪α1,3半乳糖水平,但是也有可能筛选得到在自然情况下α1,3半乳糖表达水平比较低的猪.为了研究在正常猪单个核细胞中α1,3半乳糖浓度分布的差异,利用鸡免疫球蛋白Y(ck-IgY)抗体通过流式细胞分析对正常猪的α1,3半乳糖水平的差异进行检测.取3～8周龄猪的全血,用肝素抗凝处理后经密度梯度离心获取外周血单个核细胞(PBMCs),与FITC标记的ck-IgY(10μg/ml)孵育,经流式细胞仪检测α1,3半乳糖水平.结果显示,相同周龄猪的α1,3半乳糖水平可有0.4～2.6倍差异,同一猪的水平在不同周龄有1.3～5.6倍差异.ck-IgY的特异性由棉籽糖和α1,3半乳二糖测定,棉籽糖(100μmol/L)可抑制70%ck-IgY结合,而α1,3半乳二糖(6.25μmol/L)可完全取消ck-IgY的结合,说明ck-IgY与猪单个核细胞是特异性结合.上述发现说明,ck-IgY是检测猪单个核细胞表面α1,3半乳糖的特异试剂,不同猪或是同一猪在不同时间的α1,3半乳糖水平有着明显的差异.     

人α-半乳糖苷酶、α-1,2-岩藻糖转移酶cDNA序列转染克服异种移植超急性排斥反应

半乳糖α 1,3 半乳糖抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (hyperacuterejection ,HAR)的主要抗原 .α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以以不同的方式降低半乳糖α 1,3 半乳糖抗原在内皮细胞表面的表达量 .将人α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因单独或连接在一起导入猪血管内皮细胞PEDSV .15中 ,检测细胞表面的抗原及异种天然抗体对细胞杀伤作用 .结果表明α 半乳糖苷酶基因可以将猪血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原清除 74 13%,而α 1,2 岩藻糖转移酶基因也可以清除 4 7 75 %的细胞表面异种抗原 ,但二者都不能达到完全清除的目的 .当α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶双基因在内皮细胞内共表达时 ,则可以基本清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 .抗原的减少也可以相应地减弱内皮细胞对异种天然抗体介导的杀伤作用的敏感性 ,尤其是双基因共表达时细胞基本不被杀伤 .结果表明 ,α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以有效地清除血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 ,克服HAR的发生 ,为下一步进行动物实验 ,探讨克服异种移植HAR提供了技术途径     

微生物α-半乳糖苷酶的研究进展

α-半乳糖苷酶在多种生物内广泛存在,微生物是目前α-半乳糖苷酶的主要来源。微生物α-半乳糖苷酶可按照底物特异性或序列同源性分类,在古菌、细菌和真菌中均存在,其性质与来源和家族有关,催化机理大多为构型保留机制,目前主要应用于食品与饲料工业,还可用于生物质降解和医药领域。展望了微生物α-半乳糖苷酶的研究趋势。本文对相关研究者具有一定的参考意义。     

制备抗α-半乳糖苷酶单克隆抗体用于检测B→O血型改造后的微量残留酶

目的:建立一种检测B→O血型改造后残留α-半乳糖苷酶的有效方法。方法:利用重组咖啡豆α-半乳糖苷酶为免疫原制备单克隆抗体,再采用间接ELISA法检测B→O血型改造后残留的工具酶α-半乳糖苷酶的量。结果:最低可检测出的残留酶量约为2.4ng/mL。结论:为B→O血型改造后残留的工具酶的检测提供了有效的方法。     

新型α-半乳糖苷酶的稳定性研究

目的：观察脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶（GAL）在不同pH缓冲液、不同温度下的稳定性,以及不同离子及还原剂对酶活性的影响。方法：以GAL对单糖底物对硝基-苯基-α-D-吡喃半乳糖苷（PNPG）的活性为主要检测指标,观察不同离子及还原剂等对酶活性的影响;观察GAL在不同pH缓冲液中和不同温度下的稳定性。结果：钙离子、锌离子、钴离子和高浓度的锰离子增强酶的活性,DTT抑制酶的活性,螯合剂EDTA的加入提高了酶活性。GAL在pH4.6～7.5时保存1 h后稳定性很好,能保持最高活性的90％以上;在4℃～45℃下保存的稳定性最好,45℃开始活性下降。结论：GAL具有很好的温度稳定性和pH稳定性,使其适用于血型转变和异种移植。     

利用重组A蛋白偶联的琼脂糖凝胶纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体

目的:采用一种简单易行的纯化方法获得高纯度α-半乳糖苷酶单克隆抗体。方法:使用重组A蛋白偶联的琼脂糖凝胶捕获和纯化小鼠腹水中的α-半乳糖苷酶单克隆抗体。结果:获得了高纯度、高效价的α-半乳糖苷酶单克隆抗体。结论:应用重组A蛋白偶联的琼脂糖凝胶纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体是一种简单、有效的方法。     

用合成多肽免疫制备人α-半乳糖苷酶A单克隆抗体

目的:获得效价高的、特异性强的抗人α-半乳糖苷酶A(α-GalA)单克隆抗体,用于法布莱氏病的诊断。方法:分析并合成人α-GalA的优势抗原表位,合成多肽,将其与载体匙孔虫戚血蓝蛋白偶联,免疫小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞株;用酶联免疫、SDS-PAGE、Western印迹和染色体核型分析等方法对杂交瘤细胞及其产生的单抗进行鉴定。结果与结论:筛选到1株杂交瘤细胞株,获得了高效价、特异性强、亲和力高的抗人α-GalA的单克隆抗体,抗体的亚型为IgG1亚型。     

一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag 的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag 的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。     

人α-半乳糖苷酶转导克服异种移植HAR的小鼠实验研究

α 半乳糖苷酶可以特异地清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 (Galα1,3Galantigen) ,此抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (HyperacuteRejection ,HAR)的主要异种抗原 .将构建好的α半乳糖苷酶转基因载体通过显微注射的方式注入小鼠受精卵 ,培育出了转基因小鼠 .结果表明 ,转基因小鼠的心、肝、肾、脾、肺组织中均有人α 半乳糖苷酶基因的表达 ,其表达可以有效减少小鼠器官表面Galα1,3Gal抗原的表达水平 ,可以降低转基因小鼠脾细胞对补体介导的杀伤作用的敏感性 .研究表明人源α半乳糖苷酶基因可用于研制不表达Galα1,3Gal抗原的转基因动物 ,从而可以降低异种器官移植HAR的反应强度 ,提高移植物的存活期     

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α-半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上,尝试了基因工程α-半乳糖苷酶在5 L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α-半乳糖苷酶的研究。在4 L无机盐培养基中接种0.4 L pPIC9K-Gal/GS115培养物,最终得到3.5 L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为2.1 g/L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点,设计了如下的纯化流程：离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带,总回收率41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明,从发酵液中纯化的α-半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α-半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。     

异种移植中Galα(1,3)Gal抗原的研究近况

同种异体组织和器官移植物供体来源有限,使得异种移植再度成为移植领域的研究热点。异种移植的主要障碍是人体内存在的天然抗体与移植物表面含有α1,3半乳糖残基[Galα(1,3)Gal,αGal]的抗原结合,激活补体系统和炎症反应,导致超急性移植排斥反应(HAR)的发生,使移植物失活。除人类和旧世纪猴外,其它所有哺乳动物的体内都含有αGal抗原,该抗原是由一组具有Galα(1,3)Gal双糖末端的糖蛋白或糖脂组成的,它的形成依赖于α1,3半乳糖基转移酶(αGT)的催化。目前,针对αGal抗原克服超急性移植排斥反应的方法主要有如下几种：(1)酶处理去除内皮细胞表面的αGal抗原;(2)物理化学方法去除人体血浆中存在的特异性天然抗体;(3)基因工程方法改造表达催化αGal抗原形成的相关酶基因,从而影响该抗原的表达。     

牛αS1-酪蛋白5′调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2 kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的PSV载体上,做为启动子,在其后连接0.76 kb的人α-乳白蛋白基因(α-LA),构建真核表达载体 αS1-LA-psv．采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力．将构建的真核表达载体 αS1-LA-psv 转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120 h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72 h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.64 g/L．实验结果表明,建立的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5′调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶．     

表达重组咖啡豆α-半乳糖苷酶的酵母工程菌的高密度发酵

用5 L发酵罐优化了重组咖啡豆α-半乳糖苷酶酵母工程菌pPIC9K-Gal/GS115(本室构建)的高密度发酵工艺.通过对发酵条件的优化,包括甘油补充量及补充时机、甲醇诱导量及诱导时机、溶氧控制、诱导时间等,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了高效表达.利用所确定的最适条件进行发酵,菌体密度最终达到368 g/L以上,每批发酵液离心后可获得3.5 L的发酵上清,上清中的蛋白含量达到3 g/L以上,目的蛋白占上清总蛋白的50%以上,含量约为1.5 g/L,上清中α-半乳糖苷酶的活性维持在80 U/ml左右.确立工艺后又进行了3次发酵试验,证明了工艺的可行性和稳定性.为重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在B→O血型改造和酶解大豆低聚糖方面的应用奠定了基础.     

短双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶基因aga1在大肠杆菌中的高效表达

短双歧杆菌（Bifidobacterium breve 203）α_D_半乳糖苷酶基因(aga1)被克隆到大肠杆菌温度诱导表达质粒pBV220中,构建重组质粒pBVaga1,转入大肠杆菌进行温度诱导表达,得到的重组酶Aga1在大肠杆菌DH5α、DH10B和BL21中的比活分别为28.08、19.44和13.85U/mg, 均高于短双歧杆菌α_D_半乳糖苷酶的比活1.76U/mg。重组质粒pBVaga1在E. coli BL21中稳定性较好。重组酶Aga1蛋白亚基分子量约67kD,最适反应温度为45℃,酶在40℃以下稳定,60℃仅剩余约5%的酶活性,70℃时酶全部失活;最适反应pH为4.0～4.4,酶在pH 3.6～6.0范围内稳定;酶对p_硝基苯酚_α_半乳糖苷的Km＝1.43mmol/L,Vmax＝35.71μmol/(L·min),对蜜二糖的Km＝261mmol/L,Vmax＝63.69μmol/(L·min);酶在蜜二糖、棉子糖水解体系中不显示转糖基活性。结果说明Aga1与已经报道的一种短双歧杆菌的α_D_半乳糖苷酶不同,是新发现的一种短双歧杆菌的α_D_半乳糖苷酶。