第二次“基因结构,克隆和表达”讨论会

自1983年中国生化学会第一次“基因的结构、克隆和表达”西安会议以来,这个领域的发展势头迅猛。在基因顺序测定法、基因顺序特征分析和表达研究的系统等层出不穷。基因表达调控的原件,得到深入的分析。增强子的组织细胞专一性和启动基因的组织细胞专一性的发现,使对细胞分化的了解进入分子水平。     

纪念DNA双螺旋结构发现30年

1981年中国生化学会南宁大会上,大家倡议在1983年召开有关基因专题的学术讨论会;定名为基因的结构、克隆和表达。当时得到苏成芝教授的支持,决定在古都西安召开,由我和祁国荣教授等负责筹备,这个会,除了论文报告之外,邀请了十个综述报告。这就是本书的主要内容。     

玉米耐渍功能基因组分析及相关基因Sicyp51的鉴定与克隆

选用耐渍性有明显差异的玉米自交系Mo17和Hz32, 对二叶一心期的幼苗进行淹水处理, 构建了这两个材料各自正向和反向的SSH(suppression subtractive hybridization)文库. 从SSH文库中筛选到105个阳性克隆; 利用处理及对照mRNA与Mo17全生育期cDNA芯片分别杂交, 得到57个3倍以上表达差异的克隆. 对所有162个克隆进行序列分析, 结果表明: 所有差异表达的克隆代表85个TUGs(tentative unique genes), 这些TUGs主要参与厌氧代谢、逆境自我保护、信号传导、细胞结构和能量代谢等生理生化途径, 同时还包括41个未知功能的cDNA, 说明玉米根系对淹水胁迫响应涉及到复杂的代谢反应. 对从Mo17和Hz32中筛选到的差异表达克隆进行比较分析发现, 在淹水条件下, 耐渍性不同的材料具有不同的耐渍相关基因的表达模式. 利用Northern及RT-PCR检测了部分阳性克隆的表达谱, 并克隆到一个与耐渍相关的新基因(Sicyp51).     

中国白兔白介素-10基因的克隆、表达及其抗体的制备

目的克隆并表达中国白兔IL-10基因,制备抗IL-10多克隆抗体。方法运用RT-PCR对从ConA诱导后的中国白兔外周血单核细胞(PMBCr)总RNA中扩增IL-10基因,克隆后进行测序和遗传进化分析,同时将其亚克隆pET28a中,在大肠杆菌中诱导表达,并用纯化的表达产物制备多克隆抗体。结果该基因全长537 bp,编码178个氨基酸。与欧洲兔IL-10基因同源性很高,但与鼠、鸡、河豚和斑马鱼等不同物种IL-10基因差异较大。经IPTG诱导后,重组菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为23.4×103的重组蛋白。Western blot分析表明,中国白兔IL-10基因已经表达。重组表达的蛋白量可占菌体蛋白的15.2%。结论成功实现了中国白兔IL-10的原核表达,制备了小鼠抗兔IL-10的多克隆抗体。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa21的分子生物学研究进展

由黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)引起的白叶枯病是水稻重要细菌性病害之一。迄今,已有7个水稻白叶枯病抗性基因被克隆。Xa21是第一个被克隆的白叶枯病抗性基因,因具有广谱抗性而受到广泛的关注。对Xa21的发现、定位及克隆、表达特征、编码产物XA21的生化特性、作用与调控以及XA21介导的免疫反应模式等方面的研究结果进行综述,并对今后的研究方向进行展望。     

抑制差减杂交法分离玉米幼苗淹水诱导表达基因

以淹水处理(submergence-treated, ST)的玉米(Zea mays L.)幼苗根部cDNA为目标群体,未处理(untreated, UT)的玉米幼苗根部cDNA为对照群体,进行抑制差减杂交.用经过UT差减的ST cDNA构建了一个含有大约2 000个独立克隆的差减文库.对随机挑取的408个克隆进行差异筛选,获得了184个在ST中特异表达或表达增强的候选克隆.对其中155个cDNA克隆测序并去除重复克隆后,共得到95个差异表达的cDNA片段.GenBank中BLAST查询结果表明:6个克隆为已知的玉米核苷酸序列;68个克隆与已知基因或EST序列部分区域的同源性为60%～90%;21个克隆在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因,或者由于序列位于变异丰富的3′端而无法查到与其他物种基因的同源性.     

中国蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库ESTs序列测定及生物信息学分析

前期我们构建了中国蛇岛蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensis,GSS)毒腺(GSSG)的cDNA(GSSG-cD-NA)文库。本文从构建的GSSG-cDNA文库阳性重组子中随机挑选了216个单克隆进行5’端表达序列标签(EST)单向测序,获得了211条高质量的ESTs。生物信息学序列比对分析结果表明84个克隆为已知功能基因,29个克隆为未知功能基因,98个克隆为新基因,分别占总ESTs的39.8%、13.7%和46.5%。成功获得了GSSG的部分ESTs序列,为GSS蛋白活性组分基因的克隆、表达和功能研究奠定了一定基础。     

拟南芥、荠菜DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建

用PCR方法从拟南芥和荠菜中分别克隆了DREB1A基因.序列分析发现从拟南芥中克隆的AtDREB1A基因与已发表的AtDREB1A基因序列(DQ372533)的同源性为99.69%.首次从荠茱中克隆的CbDREB1A基因序列(EF156749)与DQ372533的同源性为99.54%.利用这两个基因分别构建了两个诱导表达载体(prd29A/AtDREB1A,prd29A/CbDREB1A)和两个组成型表达载体(pCaMV35S/AtDILEBlA,pCaMV35S/CbDREB1A),以便进一步开展植物抗旱基因工程研究.     

三芒山羊草中新型储藏蛋白基因Avenin-like的克隆及分析

目的:克隆三芒山羊草(Aegilops neglecta)中新型avenin-like基因,揭示avenin-like基因的表达模式,并对克隆的基因进行相关的分析.方法:利用RT-PCR的方法揭示avenin-like基因的表达模式,并用PCR方法从三芒山羊草中克隆新型的ave-nin-like基因.结果:avenin-like基因在胚乳中特异性表达;克隆得到新型的avenin-like基因;avenin-like基因属于醇溶蛋白超基因家族,含19个半胱氨酸残基、形成8对分子内二硫键和3对分子间二硫键.结论:新型avenin-like基因的克隆为小麦品质改良提供了很好的基因资源.     

人工合成脑啡肽基因在细菌中的功能表达首次在我国获得成功

据《生命的化学》(1982.2(4):9.26)报导,中国科学院上海生化所科研人员经两年的努力于今年五月成功地实现了lcu脑啡肽基因的人工合成及其基因在大肠杆菌中克隆和表达。 脑啡肽存在于动物脑中的一种由5个氨基酸组成的神经肽,是一种有效的镇痛剂。     

北京棒杆菌转酮酶:基因克隆、序列分析与表达

【目的】转酮酶是非氧化磷酸戊糖途径中的关键酶。从北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense PD-67)中克隆转酮酶(transketolase,EC2.2.1.1,TK)基因,并将转酮酶基因在C.pekinense PD-67中进行表达,研究增加转酮酶活性对C.pekinense PD-67生理特性的影响。【方法】分别以C.pekinense野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增tkt的全基因序列和前端控制序列;通过pAK6载体提高tkt基因在C.pekinense PD-67中的拷贝数,从而提高C.pekinense PD-67中转酮酶的活性。【结果】tkt基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与结构分析结果表明,C.pekinense突变株PD-67与野生株AS1.299相比较,二者调控序列及结构基因核苷酸序列完全一致。与谷氨酸棒杆菌ATCC13032相比较,突变株PD-67的氨基酸序列有5个氨基酸差异,其中4个位于与辅因子硫胺素焦磷酸结合的结构域内。突变株PD-67来源的tkt基因在北京棒杆菌PD-67中得到了表达,重组菌转酮酶比活力比对照菌株提高了2倍。C.pekinense PD-67(pTK3)与对照菌株PD-67(pAK6)相比,生长加快,L-色氨酸的最终积累量也较高。【结论】本工作从C.pekinense1.299和PD-67中克隆到tkt基因,并实现tkt基因的同源表达。适当提高菌株转酮酶活力,有助于菌体生长和色氨酸积累。     

北京油鸡ADSL基因的克隆、表达及其结构与功能分析

采用RT-PCR与RACE方法扩增出北京油鸡腺苷酸琥珀酸裂解酶(ADSL)基因全长cDNA序列,亚克隆和序列分析结果表明:该基因开放阅读框长为1455个碱基,编码485个氨基酸;5'端非转录调控区具有典型管家基因的特征,在临近起始密码子27号碱基发生C→T突变,该突变使得本来小是核呼吸因子2(NRF-2)结合位点的CTCC突变为NRF-2结合位点CTTC.将ADSL基因完整斤放阅读框重组至融合表达载体pGEX-4T-l中,构建成北京油鸡ADSL基因融合表达载体pOEX-ADSL,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性克隆,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白在约80.5kD处有特异蛋白条带出现,与预期分子量大小一致,等电点为6.79.该蛋白的表达最随诱导时间的延长而增加,5h达最高值,达到细胞总蛋白的26.9%,且主要以不可溶的包涵体形式存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后Western blotting检测表明其为北京油鸡ADSL蛋白,为其进一步的生物学功能及其应用研究鉴定基础.     

利用有序差异显示技术克隆受稻瘟病菌诱导表达的水稻cDNA的研究

利用有序差异显示技术(ODD)分析受稻瘟病菌诱导表达的水稻基因,通过反式RNA印迹进行辅助筛选,获得了37个在接种稻瘟病菌后表达量增强的水稻cDNA克隆.采用RNA印迹对其中5个克隆在接种稻瘟病菌后的表达分析表明,这些克隆在抗病以及感病的水稻株系中都具有诱导表达的特点.根据序列同源性分析,与这些克隆序列相应的同源基因可能涉及抑制病原菌生长、清除真菌毒素、传递抗病信号以及调节宿主生理状态等几方面的功能.     

杀菌/通透性增加蛋白基因的克隆及在CH0细胞中的表达

从一名健康中国人外周血白细胞中克隆出杀菌/通透性增加蛋白(BPI)基因,全长1452bp,编码27个氨基酸的信号肽和456个氨基酸成熟蛋白.序列比较发现,此序列与国外发表的序列有6个核苷酸的差异,编码蛋白有4个氨基酸的差异.构建真核表达质粒,在CHO细胞中实现BPI基因的稳定表达.对重组蛋白初步纯化后进行杀菌实验,结果表明重组蛋白具有与天然蛋白同样的生物活性.     

鸡Slc24a5基因的cDNA克隆、表达分析及其与黑色素沉积的关系研究

黑色素是一种由醌/吲哚-醌来源的混合物组成的生物高分子化合物.目前在小鼠中已发现的和黑色素沉积相关的基因已经超过了100个.Slc24a5(solute carrier family 24,member 5)基因是在斑马鱼中克隆的一个新基因.研究表明,Slc24a5基因可以调控斑马鱼中的黑色素沉积.鸡作为一种模式动物,已经广泛地被应用于实验研究.为了研究Slc24a5基因在鸡中的情况,克隆了鸡Slc24a5基因全长CDS,并且分析了其与黑色素沉积的关系.鸡Slc24a5基因全长CDS为1 269 bp,编码一个423氨基酸残基的蛋白质.该蛋白质比哺乳动物中的少大约80个氨基酸残基.基因全长超过11 kb,包含8个内含子和9个外显子.RT-PCR结果显示,鸡Slc24a5基因在多处组织表达(眼、脑、皮、肉、心、肝、肾和肺).通过荧光实时定量PCR对不同鸡种中的Slc24a5基因表达量进行检测,发现其在白莱杭,乌骨鸡和北京油鸡的眼睛中表达量很高.并且在乌骨鸡的皮肤和肌肉中Slc24a5基因也有很高的表达.乌骨鸡眼睛中的Slc24a5基因表达量为白莱杭的2倍.而在乌骨鸡皮肤中,Slc24a5基因表达量为白莱杭的70倍,为北京油鸡的15倍.Slc24a5基因在乌骨鸡肌肉中的表达量为白莱杭的15倍,为北京油鸡的3倍.同时通过对这3个鸡种中黑色素在各组织中沉积量进行分析,发现黑色素沉积越多的地方,Slc24a5基因表达量越高.这些结果表明鸡Slc24a5基因的表达与鸡中黑色素的沉积相关.     

通过小麦Ms2近等基因系的抑制缩减杂交分析揭示小穗和花药中差异表达基因

以Ms2近等基因系处于减数分裂期的可育小穗cDNA作为驱动因子(driver),以同一时期的不育小穗cDNA作为测验因子(tester)进行缩减杂交(SSH),将扩增后的缩减杂交产物进行克隆,构建了一个包含882个重组克隆的SSH文库.分别以可育小穗和不育小穗的cDNA为探针与SSH文库克隆进行反式Northern杂交,结果显示接近90%的克隆在不育小穗中呈上调表达.对文库中21个克隆插入片段的序列相似性分析表明其中有18个与来源于穗部或减数分裂期的花药cDNA同源.13个克隆的编码产物与已知功能的蛋白质同源,其中5个参与碳代谢活动,4个参与胞内分子的运输,2个蛋白产物参与染色体的构成及染色体的结构变化,1个是生长素抑制蛋白,1个是转录因子.用中国春缺体四体材料对9个克隆进行了染色体定位,其中一个克隆定位于第四染色体同源群,与Ms2所在的染色体同属一个同源群.通过搜索水稻的同源BAC(bacterial artificialchromosome)和PAC(P1 artificial chromosome)克隆,推测另外11个克隆的染色体位置,其中4个克隆可能位于第四染色体同源群.用RNA点杂交对11个克隆进行表达谱分析,其中8个克隆在不育株的小穗和花药中呈上调表达.     

激活蛋白处理水稻引发基因差异表达的研究

利用抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)成功构建了植物激活蛋白处理水稻与非处理组水稻中差异表达的消减cDNA文库。从文库中一共筛选到1756个克隆,通过反向Northern杂交,从中得到264个有效克隆并测序,利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对分析,获得28个上升表达差异基因。通过分析这些基因与植物的光合作用、营养物质的运输代谢等多种植物的生理生化功能相关。本研究为揭示激活蛋白的作用机理奠定基础。     

棉蚜溶菌酶基因AgLYS的克隆与表达分析

【目的】克隆棉蚜Aphis gossypii Glover溶菌酶基因并进行原核表达,分析其在不同日龄和不同寄主植物上棉蚜体内的表达特征,为进一步研究溶菌酶的功能及其与棉蚜共生菌间的关系奠定基础。【方法】以无翅棉蚜成虫总RNA为模板,采用RT-PCR与RACE方法获得棉蚜溶菌酶基因的cDNA全长序列;将信号肽序列剪切后的棉蚜溶菌酶基因片段连接到原核表达载体pET-30a,并转化到大肠杆菌Eschericha coli中进行诱导表达;采用定量PCR方法测定该基因在不同日龄(1-19日龄)以及西葫芦、黄瓜和豇豆等不同寄主植物上棉蚜体内的相对表达量。【结果】克隆获得棉蚜溶菌酶基因,命名为AgLYS(Gen Bank登录号:KY575341),cDNA全长为680 bp,开放阅读框为516bp,编码172个氨基酸残基。AgLYS的N-末端含有长度为36个氨基酸残基的信号肽序列。系统发育分析表明,棉蚜溶菌酶属于i型溶菌酶,并且与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum i型溶菌酶基因的氨基酸序列一致性达90%。AgLYS可在大肠杆菌中诱导表达,表达蛋白分子量为20 k D左右。AgLYS在1-19日龄的棉蚜体内均有表达,但在1-9日龄棉蚜体内表达量较低,11日龄后的棉蚜体内表达量极显著升高(P0.01)。同时,在西葫芦上饲养的棉蚜体内AgLYS的表达量极显著高于在黄瓜和豇豆上饲养的棉蚜体内的表达量(P0.01)。【结论】从棉蚜中克隆获得了i型溶菌酶基因AgLYS,并在大肠杆菌中诱导表达。棉蚜AgLYS基因的表达量受蚜虫日龄及所取食寄主种类的影响,推测棉蚜i型溶菌酶AgLYS可能与棉蚜体内共生菌种群密度的调控相关。     

用改良消减杂交筛选类风湿性关节炎滑膜细胞中高表达基因

 为了研究类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis,RA)滑膜细胞 (fibroblast- like synovialcells,FLS)过度增殖和破坏软骨的分子机理 ,利用改良消减杂交法以骨性关节炎 (osteoarthritis,OA)病人滑膜细胞为对照 ,筛选 RA滑膜细胞中的高表达基因 .将得到的基因片段克隆入质粒载体 ,通过反向点杂交排除假阳性克隆后 ,将阳性克隆进行核酸序列分析 ,最后用 Northern杂交方法检测一些高表达基因在 RA和 OA病人滑膜细胞中的表达水平 .结果显示 ,共分离到 1 50个 RA高表达基因片段 ,其中长于 1 0 0 0 bp的片段占 8% (1 2 /1 50 ) ,长于 40 0 bp的片段占 36.7% (55/1 50 ) ,在大于 40 0 bp的片段中 ,假阳性率为 2 3.7% (1 3/55) .在测序的 1 8个片段中 ,已知基因有 1 2个 ,其中包括 IGF- 1结合蛋白 (IGFBP)特异性丝氨酸蛋白酶、层粘连蛋白受体和组织蛋白酶 B等 .新序列有 6个 ,其中两个序列分别与 Ring- box蛋白 1和 SON DNA结合蛋白同源 .对 IGFBP特异性丝氨酸蛋白酶、层粘连蛋白受体和组织蛋白酶 B基因的 Northern杂交分析显示 ,在 RA病人滑膜细胞中 ,这些基因的表达水平高于 OA病人滑膜细胞 .这些结果提示 ,这种改良消减杂交法是一种简便有效的分离差异表达基因的方法 ;IGF- 1结合蛋白特异性丝氨酸蛋白酶、层粘     

不结球白菜BcTuRsO基因的克隆及表达

从不结球白菜抗病品种短白梗中克隆到一个抗芜菁花叶病毒(TuMV)相关基因,命名为BcTuRsO(Gen-Bank登录号FJ600376).该基因核苷酸序列全长650 bp,编码194个氨基酸,与已克隆的抗病基因有不同程度的同源性.系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性.基因组DNA杂交表明,BcTuRsO基因可能以单拷贝形式存在,其表达是组成型的.实时定量PCR检测表明,芜菁花叶病毒能够诱导不结球白菜BcTuRsO基因的转录表达,其在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病毒的抗性.