运动发酵单孢菌ZM4 adh Ⅱ基因的克隆及在大肠杆菌TOP10中的表达

利用高保真聚合酶从运动发酵单胞菌中克隆出乙醇脱氢酶基因,加A后克隆到pGM-T载体,测序验证无误。经酶切、酶连到表达载体pUC-18。形成重组质粒pUC-18-adhⅡ,转化到大肠杆菌TOP10中,经定性定量分析乙醇脱氢酶酶基因在大肠杆菌中高效表达,成功构建出乙醇脱氢酶基因的表达载体。     

酿酒酵母adh2和ald6双基因缺失突变株的构建

酿酒酵母乙醇合成代谢过程中, 阻断或削弱乙醛至乙酸代谢流不但能增强乙醇合成流, 同时还能降低发酵乙酸含量。本研究以乙醇脱氢酶Ⅱ(adh2)基因缺陷型酿酒酵母YS2-Dadh2为出发菌株, 应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建乙醛脱氢酶Ⅵ(ald6)基因敲除组件, 转化酿酒酵母YS2-Dadh2敲除ald6基因, 之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中, 半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kanr基因筛选标记, 最后, 传代丢失质粒pSH65获得单倍体ald6基因缺失突变株。利用同样的敲除组件和技术再次敲除其等位基因, 最终获得双基因缺失突变株YS2-△adh2-Dald6。发酵实验表明与出发菌株YS2相比, 突变株乙酸合成量降低18%, 乙醇最高产量提高12.5%。     

小鼠精胺氧化酶的原核表达与鉴定

目的:原核表达和分离纯化小鼠精胺氧化酶(SMO)。方法:采用RT-PCR法从小鼠胚胎干细胞(ES细胞)RNA中克隆小鼠SMOcDNA,构建SMO原核表达质粒并转染大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,将表达的小鼠SMO重组蛋白在变性条件下经Ni-NTA树脂亲和层析纯化和透析复性。结果:在大肠杆菌中高表达出小鼠SMO重组蛋白;纯化并透析复性后的重组SMO具备快速氧化特异性底物精胺的酶活性。结论:建立了原核表达和纯化有活性小鼠SMO的实验方法。     

运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,以基因组DNA为模板克隆得到运动发酵单胞菌(Zyrnomonas mobilis)乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenaseⅡ)基因adhB,连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSE-adhB。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α中,重组菌株经IPTG诱导后,在乙醛指示平板检测到乙醇脱氢酶活性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的40KD特异性蛋白质条带。重组菌株经诱导培养,每毫升发酵液酶活力为5u。     

羊口疮病毒蛋白ORFV035的表达、纯化和多克隆抗体的制备

克隆表达羊口疮病毒蛋白ORFV035,并制备其多克隆抗体,为后续对病毒复制、装配、形态发生和成熟过程的研究奠定基础。PCR扩增羊口疮病毒ORFV035基因,将其与质粒pET-30a(+)经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET30a-035。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化感受态大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。表达产物进行超声破碎和Ni柱纯化,纯化后目的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体并对其进行鉴定。成功构建了重组质粒pET30a-035,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达。包涵体洗涤、溶解后进行Ni柱纯化,得到纯度较高的ORFV035-his融合蛋白。以纯化蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体。Western blot检测显示该多抗可以识别天然ORFV035蛋白。成功诱导表达、纯化ORFV035蛋白并制备ORFV035多克隆抗体。     

肺炎支原体铁吸收调节蛋白基因的克隆表达与纯化

[目的]克隆肺炎支原体铁吸收调节蛋白(Fur)基因并纯化Fur蛋白,为研究其生物学功能奠定基础。[方法]利用Clustal Omega分析肺炎支原体Fur蛋白及其同源序列并用MEGA6.0构建进化树,通过PCR扩增Fur基因并对其进行双酶切,然后连接到p ET28a,得到重组载体p ET28a-Fur,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导Fur蛋白表达,并通过亲和层析纯化Fur蛋白。[结果]多序列比对和进化树分析表明Mp含有一个Fur蛋白。克隆得到大小为477 bp的Fur基因,编码159个氨基酸。得到重组表达质粒p ET28a-Fur,该质粒能在大肠杆菌中能高效表达,并纯化得到重组Fur蛋白。[结论]成功克隆获得Mp Fur基因,在大肠杆菌中高效表达并获得高纯度Fur蛋白。     

高山被孢霉ATCC16266Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

Δ6 脂肪酸脱氢酶是形成γ 亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT MACL6中 ,酶切出 1 4kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYMAD6 ,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INCSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了 31 6 %的γ 亚麻酸。这是迄今为止 ,国内外Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

木酮糖激酶基因整合表达载体构建及在酿酒酵母中的过表达

【目的】以载体p406ADH1为构建骨架,构建一个酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工业菌株的整合表达载体。【方法】通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为筛选标记的G418抗性基因KanR,用于基因表达的ADH1终止子片段,酿酒酵母W5自身木酮糖激酶基因,18S rDNA介导的同源整合区,插入到骨架质粒p406ADH1中,得到多拷贝整合表达载体pCXS-RKTr。将该载体线性转化酿酒酵母后,对转化子中木酮糖激酶酶活进行测定,检测其表达情况。【结果】重组质粒在酿酒酵母体内实现了木酮糖激酶的高水平稳定表达,其酶活力是初始菌株的2.87倍。【结论】本实验构建了一个酿酒酵母工业菌株整合表达载体,并用此载体过表达了其自身的木酮糖激酶基因。该重组质粒载体的构建可以有效解决酿酒酵母中自身木酮糖激酶酶活较低的情况,这为利用木糖高产乙醇酿酒酵母基因工程菌株的构建和其它酵母重组质粒载体的构建奠定基础。     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

鲍曼不动杆菌铁蛋白的抗氧化功能研究

【目的】克隆鲍曼不动杆菌铁蛋白(Abferritin)基因,并研究其抗氧化功能。【方法】荧光定量PCR检测氧化应激下Abferritin基因的表达量,并将其基因克隆到表达载体p ET28a以构建重组质粒p ET28a-Abferritin,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌BL/p ET28aAbferritin,IPTG诱导目的蛋白表达并利用镍柱亲和层析纯化该蛋白。比色法测定Abferritin蛋白的Fe2+氧化酶活性,自由基清除实验测定其抗氧化功能。菌落计数法观察重组大肠杆菌在H2O2应激条件下的存活率。【结果】Abferritin基因在氧化应激下表达增高。重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,通过Ni2+亲和层析纯化获得了Abferritin蛋白。该蛋白具有Fe2+氧化酶活性,能有效减少氧自由基的形成及提高大肠杆菌抵抗氧化应激的能力。【结论】氧化应激能诱导Abferritin基因表达上调,且该蛋白具有亚铁氧化酶活性和抗氧化功能。     

鸡源抗菌肽Fowlicidin-2在大肠杆菌中的 重组表达及其生物学活性鉴定

【目的】对抗菌肽Fowlicidin-2基因进行克隆与表达,并鉴定其生物学活性。【方法】根据抗菌肽Fowlicidin-2氨基酸序列,依照大肠杆菌(E.coli)密码子的偏爱性,人工设计合成其编码基因。与质粒pET-32a连接,构建重组表达载体,转化表达宿主菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,融合蛋白经溴化氰裂解后进行纯化,测定重组抗菌肽的抑菌活性。【结果】Fowlicidin-2融合蛋白以包涵体形式表达,经溴化氰裂解后,成功释放出Fowlicidin-2,获得的重组Fowlicidin-2对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有明显的抑菌效果。【结论】实现了抗菌肽Fowlicidin-2的重组表达,为抗菌肽的重组量化制备提供了理论基础与技术手段。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

OKP-B-13型β-内酰胺酶的克隆与表达

目的构建OKP-B-13型β-内酰胺酶的表达载体。方法抽提菌株的质粒,应用PCR扩增OKP-B-13基因全长编码序列,扩增产物经Nde I、Xho I酶切后连接至pET-26b(+)表达载体,重组质粒经酶切及DNA测序确证后,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。超声破碎法提取表达蛋白产物,检测其活性,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点(pI)。结果PCR扩增获得879 bp的产物,重组表达载体经Nde I、Xho I酶切及DNA测序后表明,目的基因已成功接入表达载体,重组菌的粗提物经头孢硝噻吩检测显示具有β-内酰胺酶活性,显示载体[pET-26b(+)/OKP-B-13]构建成功。目的等电点为7.1。结论β-内酰胺酶OKP-B-13在原核表达细胞中实验了基因重组表达,为进一步分析酶的特性提供条件。     

单链抗体scFv-GCN4在大肠杆菌中的重组表达及活性检测

目的:重组表达融合GST或MBP标签的单链抗体scFv-GCN4,对其进行分离纯化,并检测其生物学活性。方法:构建pBAD-MBP-scFv-GCN4及pBAD-GST-scFv-GCN4表达载体,使用大肠杆菌(Escherichia coli)Top10菌株表达并亲和纯化重组蛋白MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4。构建p ET30a-Nus-GCN4载体,使用E.coliBL21(DE3)菌株表达重组蛋白Nus-GCN4及Nus。以重组的GCN4为特异性抗原,通过Pull-down技术和WesternBlot技术,检测MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4的抗体活性及特异性。结果:重组菌株E.coli Top10可高效表达可溶性的MBP-scFv-GCN4和GST-scFv-GCN4蛋白,通过亲和纯化,均得到了高纯度的重组蛋白。重组菌株E.coliBL21(DE3)可高效表达可溶性的Nus与Nus-GCN4蛋白。Pull-down及WesternBlot结果显示,重组蛋白MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4均可以高效、特异地识别重组的GCN4抗原。结论:重组抗体GST-scFv-GCN4及MBP-scFv-GCN4均可在E.coli中高效表达,并且具有良好的抗体活性及特异性。     

鼠李糖乳杆菌D-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR的方法从鼠李糖乳杆菌基因组DNA中扩增到D-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhD),并连接到载体pSE380上,构建表达质粒pSE-ldhD,将重组质粒pSE-ldhD转化大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明ldhD在大肠杆菌中实现了表达,表达产物的分子量约为37kD。同时采用紫外分光光度法测定D-乳酸脱氢酶的酶活,测得重组菌株的D-乳酸脱氢酶活力为5.4U/mL,最适反应温度为35℃,最适pH为5.6。     

在DH5α中拼接构建ADAM10全长真核表达载体的基因突变

目的:构建ADAMI0真核表达载体,为进一步研究其生物学功能打基础.方法:将人ADAM10的上下两部分基因片段(分别为全长基因的1 ～910bp和911 ～2 247bp片段),依次与真核表达载体pcDNA3.1相连,以大肠杆菌DH5α或BL21(DB)作为感受态宿主菌用于转化连接产物,拼接成全长的阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定.结果:ADAM10下段基因与已正确连入上段的pcDNA3.1重组质粒拼接时,若用DH5α为感受态菌,则下半段出现碱基插入增加512bp,测序结果显示为ADAM10基因第1 531 bp～2 042 bp间的序列有紧邻的双份;若用BL21(DE3)为感受态,则无突变.结论:将ADAM10基因与pcDNA3.1真核表达载体依次拼接构建重组质粒时,以DH5α为宿主菌可出现基因序列增加的罕见突变,而以BL21(DE3)为宿主则无突变,由此成功构建ADAM10全长基因与pcDNA3.1的重组质粒.     

尿酸氧化酶基因的克隆、表达及其产物的应用

克隆了产朊假丝酵母(Candida utilis)AS2-117尿酸氧化酶(Urate Oxidase,Uricase,EC1.7.3.3)的基因。将此基因插入原核表达质粒pET21a后转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高表达的重组转化子菌株。经IPTG诱导,重组尿酸酶基因表达量可达菌体可溶性蛋白的40%。重组尿酸氧化酶为有酶活性的可溶蛋白。Western印迹分析证实表达产物有免疫学活性。经DEAE DE52纤维素离子交换柱层析纯化,目的蛋白纯度可达95%。重组蛋白和天然蛋白的理化特征比较证明重组蛋白的热稳定性有较大提高。酶盒配制和临床应用实验表明重组蛋白可代替天然蛋白进行临床血清尿酸的分析。     

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatinC端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatinC端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET／mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatinC端片段的cDNA长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatinC端片段氨基酸的同源性为61％。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28％,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatinC端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中高效表达。小鼠canstatinC端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。