具核梭杆菌通过调节肠道代谢产物丁酸钠上调Cdk1促进结直肠癌发展

该文探讨了肠道微生物具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)通过调节代谢产物丁酸钠(NaB)对结直肠癌(CRC)发生发展的影响及其分子机制。提取临床组织RNA和蛋白,RT-qPCR和Western blot检测肿瘤组织与正常/癌旁组织Cdk1的mRNA及蛋白表达,同时检测具核梭杆菌的mRNA的相对水平,并分析其与Cdk1的相关性。具核梭杆菌处理结直肠癌细胞24 h后检测周期相关蛋白Cdk1和P21的表达水平,核磁共振检测培养基上清差异代谢物。不同浓度差异代谢物NaB处理结直肠癌细胞DLD-1、SW480、HCT116,使用MTT和克隆形成实验检测DLD-1、SW480、HCT116增殖能力。流式细胞术检测NaB对结直肠癌细胞SW480周期阻滞位点,Western blot检测周期相关蛋白Cdk1、P21、C-myc的表达水平。流式细胞术检测NaB处理后结直肠癌细胞SW480凋亡率变化情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-Casepase3、Cleaved-PARP、Bcl-2的表达水平。采用MTT实验检测不同MOI具核梭杆菌作用结直肠癌细胞4、8、24 h后对其增殖能力的影响。将结直肠癌细胞与具核梭杆菌共培养24 h,Western blot检测相关蛋白Cdk1、c-myc、Cleaved-Caspase3的表达情况。结果显示,在肿瘤组织中Cdk1蛋白水平和mRNA水平均明显高于正常/癌旁组织(P0.05),并且Cdk1与具核梭杆菌mRNA表达水平存在一定相关性。具核梭杆菌处理结直肠癌细胞DLD-1和HCT116后,Western blot结果显示Cdk1和P21蛋白水平上升。核磁共振结果表明,菌处理组代谢模式与未处理组存在明显差异,主要代谢物NaB相对含量明显低于未处理组(P0.01)。使用1 mmol/L NaB处理结直肠癌细胞系DLD-1、SW480、HCT116 24 h后,细胞生存率分别为(89.18±1.92)%、(85.07±0.61)%、(83.59±2.18)%,且随着药物浓度升高,药物对细胞活性的抑制率逐步上升。同时,经1 mmol/L NaB处理后,DLD-1、HCT116和SW480细胞的克隆形成率相比于对照分别下降了(20.07±4.85)%、(36.47±5.31)%、(31.13±5.22)%。流式检测细胞周期显示,NaB引起结直肠癌细胞S期阻滞。NaB处理结直肠癌细胞24 h后,周期相关蛋白P21表达水平上升,Cdk1、C-myc蛋白表达水平下降(P0.05)。流式检测细胞凋亡显示,NaB引起结直肠癌细胞SW480凋亡增加。NaB处理结直肠癌细胞24 h后,凋亡相关蛋白Cleaved-Casepase3、Cleaved-PARP表达水平上升,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降。MOI=50的具核梭杆菌分别处理结直肠癌细胞SW480、HCT116 4 h后,细胞增殖率分别增加了(4.45±0.25)%、(2.61±0.75)%;并且随着具核梭杆菌MOI的增加和处理时间的延长,结直肠癌细胞的增殖率逐渐上升。将SW480细胞与HCT116细胞与具核梭杆菌共培养24 h,Western blot结果显示,具核梭杆菌感染促进了周期相关蛋白Cdk1、C-myc的表达,而其与NaB共同处理时则大大减弱了这一作用;NaB诱导Caspase3的剪切,导致Cleaved-Caspase3表达增加,而具核梭杆菌感染则减弱了这一作用。综上所述,肠道微生物具核梭杆菌通过调节肠道代谢物NaB上调Cdk1,促进结直肠癌细胞增殖,抑制结直肠癌细胞凋亡,进而影响结直肠癌的发生发展。     

叉头盒蛋白M1的表达水平与结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的关系

叉头盒蛋白M1 (forkhead box protein M1, FOXM1)是细胞分化和增殖的重要调节因子,目前已经证实FOXM1在多种肿瘤细胞中高度表达,然而其在结直肠癌细胞中的作用尚不明确。为了揭示FOXM1的表达水平与结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的关系,本研究检测了53例结直肠癌患者的肿瘤组织和邻近非癌组织中的FOXM1表达水平。此外,应用FOXM1 siRNA转染人结直肠癌细胞系SW620,并考察FOXM1敲低对细胞增殖、侵袭和迁移的影响。免疫组化结果显示,92.45%的结直肠癌组织为FOXM1高表达(49/53),18.87%的相邻非癌组织为FOXM1高表达(10/53),FOXM1在不同组织间差异显著(χ~2=58.141, p=0.001)。QRTPCR和Western blotting分析显示,结直肠癌组织中FOXM1的m RNA和蛋白表达水平显著高于邻近非癌组织(p0.05)。此外,siRNA敲低SW620细胞中FOXM1的表达后,CCK8检测显示FOXM1沉默显著降低SW620细胞的增殖活性;Transwell测定和细胞划痕愈合结果显示,FOXM1沉默显著降低细胞的侵袭和迁移能力(p0.05)。表明FOXM1可能介导结直肠癌的发病机制,其有望成为结直肠癌分子治疗的有效靶点。     

芍药苷对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的观察芍药苷对人结肠癌SW480细胞株增殖、侵袭、迁移的影响,探究其干预机制。方法含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基常规培养人结肠癌SW480细胞株,CCK-8以及EdU-488法检测芍药苷对SW480细胞增殖的影响,Transwell小室检测芍药苷对SW480细胞侵袭、迁移的影响,Westernblot法检测beclin1、Bcl-2蛋白的表达。结果不同浓度芍药苷分别处理24h、48h、72h的结肠癌SW480细胞增殖活性受到显著抑制:相比较对照组,160μg/ml芍药苷处理48h后,SW480细胞内黄绿色荧光减弱,细胞增殖率显著下降,为(58.91±4.99)%;SW480细胞的侵袭细胞数、迁移细胞数显著下降:侵袭抑制率为26.50%,迁移抑制率为24.67%;beclin1蛋白表达高于对照组,Bcl-2蛋白表达低于对照组,beclin1与Bcl-2蛋白表达呈负相关。结论芍药苷能够抑制结肠癌SW480细胞增殖、侵袭和迁移,其机制可能通过抑制Bcl-2蛋白表达,上调beclin1蛋白的表达。     

沉默FOXQ1可逆转SW480细胞的上皮-间质转化

FOXQ1是FOX家族的的重要成员之一,其参与了多种人类肿瘤的上皮间质转化(epithelial- mesenchymal transition,EMT).本研究设计合成了FOXQ1基因的shRNA（short hairpin RNA）,用此转染SW480细胞,通过显微镜观察细胞形态,Transwell小室、细胞黏附试验检测转移能力及黏附能力,以探索FOXQ1与结直肠癌细胞EMT的关系.结果显示,沉默FOXQ1后,SW480细胞顶底极性及细胞间紧密连接增加,侵袭、迁移的细胞数目减少,同种黏附能力增加,异种黏附能力降低.进一步的机制研究表明,沉默FOXQ1基因可以导致SW480细胞的上皮标志因子E-cadherin表达显著增高,而间质细胞标志因子N-cadherin、Vimentin及MMP2表达均降低.以上结果表明,沉默FOXQ1基因可以逆转SW480细胞EMT,其机制可能与E-cadherin的上调和N cadherin、Vimentin、MMP2的下调有关,这为进一步研究FOXQ1在结直肠癌发生发展中的作用提供实验基础.     

FOXG1在结直肠癌侵袭及转移中的作用及机制

构建叉头框G1(Forkhead box G1,FOXG1)的慢病毒干扰(shRNA)质粒及表达质粒,通过敲低和过表达FOXG1探讨其对结直肠癌细胞上皮-间质转化EMT的作用及其机制。应用Western blotting检测FOXG1在RKO、SW480、SW620、LOVO、DLD-1五种结直肠癌细胞中蛋白的表达水平,设计并合成FOXG1的shRNA片段(shFOXG1),运用DNA重组技术获得重组质粒,经双酶切技术及测序方法鉴定后进行慢病毒的包装、纯化及稳定转染,经筛选后获得稳定的结直肠癌细胞株,通过Western blotting和qRT-PCR技术检测FOXG1敲低和过表达效率及EMT关键因子E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Snail、Twist mRNA和蛋白的变化,光学显微镜观察敲低后细胞形态学变化,通过划痕实验检测迁移能力变化,Transwell检测侵袭迁移能力的变化。5种结直肠癌细胞中,FOXG1在RKO细胞中蛋白表达量最高,而在DLD-1细胞中表达量最低,与对照组相比较,在RKO细胞中敲低FOXG1,细胞形态由长梭型变成了类圆形或者多边形,细胞极性和紧密连接增加,细胞迁移距离明显降低,侵袭转移穿过小室的细胞数也明显减少,EMT关键因子E-cadherin表达增高,Vimentin、Fibronectin、Snail、Twist表达降低,过表达FOXG1组则相反。FOXG1在结直肠癌中高表达,这种基因的高表达能够促进结直肠癌细胞的侵袭和转移,对结直肠癌细胞的EMT起着重要的调控作用。     

地高辛对结直肠癌细胞株体外生长的影响

该文研究了地高辛(digoxin)对结直肠癌HT29、SW480和SW620细胞株增殖、迁移和侵袭能力以及上皮–间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。采用MTT检测不同浓度地高辛分别作用于HT29、SW480和SW620细胞株24、48、72 h后的细胞增殖。采用划痕实验测量细胞的迁移率。采用Transwell侵袭实验测定细胞侵袭能力。采用Western blot测定相关上皮–间质转换标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、SNAIL、Slug和波形蛋白(vimentin)以及VEGF蛋白质水平。RT-PCR检测地高辛干预细胞后VEGF mRNA水平。结果发现,地高辛能有效抑制HT29和SW480细胞的增殖,且具有浓度和时间依赖性,但对SW620细胞无显著抑制作用。地高辛能够抑制HT29和SW480细胞的迁移和侵袭能力,但对SW620细胞无显著作用。EMT标志物检测结果发现,与对照组相比,HT29和SW480细胞E-钙黏蛋白水平显著升高,N-钙黏蛋白、SNAIL、Slug、波形蛋白水平显著降低,SW620细胞E-钙黏蛋白水平显著升高,Slug蛋白质水平显著降低,但VEGF水平在SW620细胞无明显改变而在HT29和SW480细胞中显著降低。与对照组相比,地高辛干预HT29细胞后,细胞中VEGF mRNA水平明显降低,而SW620细胞无显著变化。结果提示,地高辛能够抑制结直肠癌细胞的增殖,抑制其EMT的发展,对治疗结直肠未转移癌具有更好的潜力。     

Rho激酶对结直肠癌细胞体外侵袭转移作用的研究

目的:观察Rho激酶对结直肠癌SW480细胞黏附、运动、迁移和侵袭能力的影响.方法:SW480细胞用Rho激酶抑制剂Y-27632处理后,分别用细胞运动实验,黏附实验和迁移、侵袭实验分析对肿瘤细胞运动、黏附、迁移和侵袭能力的影响.结果:25μmol/L以上的浓度的Y-27632作用于SW480细胞后,细胞的运动能力、迁移能力明显下降(p＜0.05),细胞黏附于纤维粘连蛋白的能力也降低(p＜0.05);而且细胞穿过人工基底膜的能力明显降低(p＜0.01).结论:Rho激酶参与结直肠癌细胞体外的侵袭转移作用,Rho激酶抑制剂有望成为有效的抗恶性肿瘤转移的药物.     

miR-598 对结直肠癌细胞转移潜能的影响

目的:探讨miR-598在结直肠癌转移中的作用和分子机制,为寻找新的结直肠癌治疗靶标提供理论依据。方法:收集30对人结直肠癌及癌旁正常组织标本,采用qRT-PCR检测miR-598的表达,采用Transwell和划痕实验确定miR-598对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响,利用在线靶基因预测软件,筛选出miR-598可能的下游靶基因Jagged 1(JAG1),利用Western blot及双荧光素酶报告基因实验检测miR-598对JAG1及上皮间质转化标志物(Vimentin及E-cadherin)表达的影响。结果:与正常肠黏膜组织对比,miR-598在结直肠癌组织中的表达水平明显降低;miR-598显著抑制结直肠癌细胞的侵袭及迁移能力;分子机制分析证实miR-598能够作用于JAG1的3'-UTR并抑制其表达;过表达miR-598显著下调Vimentin的表达水平,而提高E-cadherin的表达水平。结论:miR-598在人结直肠癌中表达明显下调;miR-598通过靶向调控靶基因JAG1的表达,抑制结直肠癌细胞EMT,从而有效的抑制了结直肠癌细胞的侵袭和迁移。     

miR-153-5p靶向SNAI1介导结直肠癌细胞的放疗抵抗

目的 探讨miR-153-5p在结直肠癌放疗抵抗中的作用,并进一步研究其潜在分子机制。方法 首先对放疗敏感细胞系SW480及放疗抵抗结直肠癌细胞系SW480R中miR-153-5p表达水平进行RT-qPCR检测;然后利用转染技术构建过表达miR-153-5p的SW480R细胞株,检测过表达miR-153后SW480R在接受放射后其细胞活力、侵袭能力、集落形成能力、凋亡水平的改变;免疫组织化学染色观察放疗敏感及放疗抵抗结直肠癌组织中SNAI1的表达差异;TargetScan分析miR-153-5p潜在靶点并利用荧光素酶实验验证;检测过表达miR-153-5p及SNAI1后SW480R细胞侵袭能力、集落形成能力及凋亡水平。结果 与SW480组相比,SW480R组细胞中miR-153-5p表达降低;过表达miR-153-5p的SW480R细胞细胞活力、侵袭能力、集落形成能力均明显减弱,而凋亡水平显著增加;与放疗敏感结直肠癌组织相比,放疗抵抗结直肠癌组织中SNAI1显著增加;SNAI1可能为miR-153-5p的作用靶点;过表达miR-153-5p及SNAI1后SW480R细胞侵袭能力、集落形...     

MicroRNA-520e通过靶向抑制AEG-1发挥抗结直肠癌特性

摘要 目的：探究MicroRNA-520e（miR-520e）在结直肠癌中的表达模式及其对细胞功能的影响。方法：采用qRT-PCR方法检测47例结直肠癌患者的癌组织和癌旁组织中miR-520e和星形胶质细胞上调基因-1（AEG-1）的mRNA表达水平。将SW480细胞分为对照组、miR-520e-mimic组、NC-mimic组、miR-520e-inhibitor组、NC-inhibitor组、miR-520e-mimic+AEG-1-pcDNA3.1组和miR-520e-mimic+NC-pcDNA3.1组。通过MTT法检测SW480细胞的增殖,通过Annexin V-FITC/PI双染色试剂盒检测细胞凋亡,通过Transwell检测细胞迁移和侵袭,通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-520e和AEG-1的靶向关系,通过qRT-PCR或Western blotting检测AEG-1、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP9、NF-κB p65（p65）和磷酸化的NF-κB p65（p-p65）的表达。结果：与癌旁组织相比,结直肠癌组织中miR-520e的表达水平降低（t=9.353,P<0.001）。与对照组相比,miR-520e-mimic组的OD_490nm 值降低,细胞凋亡率升高,细胞迁移和侵袭数量降低,MMP2、MMP9和p-p65蛋白表达水平降低（P<0.001）。与对照组相比,miR-520e-inhibitor组的OD_490nm 值升高,细胞凋亡率降低,细胞迁移和侵袭数量升高,MMP2、MMP9和p-p65蛋白表达水平升高。与NC-mimic组相比,miR-520e-inhibitor组的相对荧光素酶活性降低（P<0.001）。与对照组相比,miR-520e-mimic组的AEG-1的mRNA和蛋白表达水平均降低,而miR-520e-inhibitor组均升高（P<0.001）。与miR-520e-mimic+NC-pcDNA3.1组相比,miR-520e-mimic+AEG-1-pcDNA3.1组的AEG-1的mRNA和蛋白表达水平升高,OD_490nm 值升高,细胞凋亡率降低,迁移和侵袭细胞数增加,MMP2和MMP9的蛋白表达水平及p65的磷酸化水平均增加（P<0.001）。结论：miR-520e在结直肠癌中表达降低,可通过靶向抑制AEG-1来发挥抗结直肠癌特性,其抗癌机制可能通过NF-κB信号通路介导。     

过表达人结肠癌细胞SW480中lncRNA CASC2a后的生物学行为影响

该文主要探究过表达lncRNA CASC2a后对人结肠癌细胞SW480在细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡方面的影响。选取人结肠癌细胞系SW480,构建lncRNA CASC2a过表达质粒模型,并通过qRT-PCR检测细胞中的lncRNA CASC2a含量。CCK-8、细胞划痕实验、Transwell、Caspase-3活性检测、TUNEL实验分别比较细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡情况,Western blot检测凋亡抗体Cleaved Caspase-3、Caspase-3、BCL-2、Bax的表达情况。结果显示,过表达lncRNA CASC2a后,SW480人结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均减弱,凋亡能力增强,Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bax蛋白表达增加,BCL-2表达减少。该研究得出,过表达lncRNA CASC2a后可抑制人结肠癌细胞SW480的增殖、迁移、侵袭能力以及诱导凋亡能力。     

白皮杉醇对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移和侵袭的影响

本研究旨在考察白皮杉醇(piceatannol, PIC)对子宫内膜癌细胞HEC-1A的初步抗肿瘤作用。分别通过CCK-8实验、平板克隆形成实验、流式细胞术、划痕损伤修复实验和Transwell小室实验检测不同浓度的PIC对HEC-1A细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。Western blot实验检测细胞增殖相关蛋白和侵袭迁移相关蛋白的表达水平。结果显示，与空白组相比，PIC能显著抑制HEC-1A细胞增殖、克隆形成能力、诱导其凋亡并减少细胞迁移距离和侵袭细胞数(P<0.01),下调p-Akt、p-Erk1/2、p-p38MAPK、β-catenin、CD44和Slug蛋白的表达水平，上调E-cadherin蛋白的表达水平(P<0.01)。综上所述，PIC呈浓度依赖性抑制子宫内膜癌HEC-1A细胞的增殖、迁移与侵袭，其机制可能与抑制AKT/ERK/MAPK信号通路和影响Wnt/β-catenin信号通路和上皮-间质转化标志物的改变有关。     

具核梭杆菌协同Cdk5促进结直肠癌细胞迁移

目的以结直肠癌细胞SW480作为研究载体,分析具核梭杆菌(F.nucleatum)对Cdk5和STAT3途径相关基因及其炎症因子表达的影响,阐明F.nucleatum协同Cdk5促进结直肠癌形成和发展的分子机制。方法以结直肠癌细胞SW480作为研究载体,运用Western Blotting、qPCR、免疫组化和细胞划痕等实验研究F.nucleatum和Cdk5对结直肠癌形成的影响。结果免疫组化结果显示,癌组织Cdk5阳性表达率明显高于癌旁组织(t=8.218,P0.01)。细胞划痕实验结果表明,F.nucleatum菌液作用的结直肠癌细胞迁移率明显高于对照组(24 h:t=5.868,P0.01; 48 h:t=6.941,P0.01)。Western Blotting结果显示,F.nucleatum协同Cdk5可能通过STAT3通路调控结直肠癌细胞凋亡。qPCR结果显示,F.nucleatum菌液作用的结直肠癌细胞的炎症因子表达明显高于对照组(IL-6:t=5.542,P0.05; COX2:t=16.893,P0.01; TNF-α:t=16.963,P0.01; IL-8:t=3.733,P0.01)。结论 F.nucleatum协同Cdk5促进了结直肠癌细胞的迁移。     

LncRNA RP11-316M1.12在甲状腺乳头状癌中的表达及对细胞侵袭、迁移的影响

目的:探讨长链非编码RNA(LncRNA)RP11-316M1.12在甲状腺乳头状癌(PTC)中的表达及对细胞侵袭、迁移的影响。方法:采用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测42例PTC组织及其相应癌旁组织中LncRNA RP11-316M1.12表达水平。体外培养TPC-1细胞,将TPC-1细胞分为LncRNA RP11-316M1.12-siRNA组(敲低组)、阴性对照组(NC组)、空白对照组(NG组),qRT-PCR法检测各组TPC-1细胞中LncRNA RP11-316M1.12表达水平,CCK-8法检测各组TPC-1细胞增殖能力,Transwell实验检测各组TPC-1细胞迁移、侵袭能力,Western blot法检测各组TPC-1细胞中上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白表达水平。结果:与癌旁组织相比,PTC癌组织中LncRNA RP11-316M1.12相对表达量明显升高(P0.05)。与NC组、NG组比较,转染24、48、72 h敲低组TPC-1细胞增殖能力受到抑制(P0.05)。与NC组、NG组比较,敲低组迁移细胞数、侵袭细胞数、间质细胞标志物波形蛋白(vimentin)、N-钙粘附蛋白(N-cadherin)蛋白相对表达量均显著降低(P0.05),上皮细胞标志物E-钙粘附蛋白(E-cadherin)相对表达量显著升高(P0.05)。结论:LncRNA RP11-316M1.12在PTC癌组织中呈高表达,沉默LncRNA RP11-316M1.12可抑制TPC-1细胞增殖、迁移、侵袭能力,其机制可能与PTC肿瘤细胞EMT过程有关。     

MiRNA-155通过调控β-catenin促进结肠癌SW480细胞的侵袭

目的:探讨micro RNA-155(miR-155)对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响及其可能机制。方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定结肠癌组织与邻近正常结肠组织中miR-155的表达。将miR-155 mimic和β-catenin特异性的siRNA(β-catenin si RNA)分别通过脂质体转染法转染入结肠癌SW480细胞,应用RT-PCR检测细胞中miR-155和β-catenin m RNA的表达,采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测β-catenin蛋白表达,采用Transwell侵袭实验检测miR-155 mimic及β-catenin si RNA对SW480细胞侵袭能力的影响。结果:结肠癌组织中的miR-155的表达较邻近正常结肠组织明显升高(P0.05);miR-155 mimic可使β-catenin的m RNA和蛋白表达均显著升高(P0.05),同时可显著增强SW480细胞的侵袭能力(P0.05),而转染miR-155 mimic和β-catenin si RNA的SW480细胞侵袭能力较仅转染miR-155 mimic的SW480细胞显著减弱(P0.05)。结论:结肠癌组织中miR-155的表达上调,可能通过激活B-catenin信号通路促进肿瘤细胞的远处侵袭转移。     

STAT3-siRNA对人结直肠癌细胞的干涉作用

目的:研究STAT3-siRNA对STAT3基因表达阳性的结直肠癌细胞凋亡的影响。方法:应用脂质体转染试剂将STAT3-siRNA表达盒(STAT3-siRNA expression cassettes,STAT3-SECs)体外转染至人结直肠癌SW480细胞及人成纤维细胞中,同时分别设立人成纤维对照组、SW480对照组、SW480错配链-SECs组和SW480空转染试剂组。于48h后收集细胞,先经荧光染色方法观察细胞表象变化,再通过流式细胞仪检测人结直肠癌SW480细胞凋亡情况,后分别提取细胞总RNA,用RT-PCR测定STAT3基因在mRNA水平的表达。结果:SW480STAT3-SECs组的细胞可见凋亡小体,出现明显的凋亡现象,而人成纤维对照组、人成纤维STAT3-SECs组、SW480对照组、SW480错配链-SECs组和SW480空转染试剂组未出现明显的凋亡现象。SW480STAT3-SECs组细胞的凋亡比率较SW480对照组、SW480错配链-SECs组和SW480空转染试剂组有明显的增高。RT-PCR所得数据经统计学处理得出:SW480STAT3-SECs组细胞的STAT3基因表达在mRNA水平上显著低于SW480对照组(P0.01);而人成纤维对照组与人成纤维STAT3-SECs组,SW480细胞对照组与SW480错配链-SECs组、SW480空转染试剂组之间无明显差异(P0.05)。结论:应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低人结直肠癌SW480细胞中STAT3的表达,诱导细胞的凋亡。     

稳定干扰ITGB1抑制人乳腺癌BT549细胞迁移和侵袭

在人乳腺癌细胞系BT549中稳定干扰整合素β1(integrinβ1,ITGB1),研究其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。构建靶向干扰ITGB1基因的sh RNA慢病毒,感染BT549细胞,通过筛选成功获得稳定干扰ITGB1蛋白的BT-549细胞系,实验设空白对照组(Blank)、病毒感染阴性对照组(shNC)、ITGB1-shRNA慢病毒感染组(shITGB1);Real-time PCR和Western blotting法检测稳定干扰后ITGB1 mRNA和蛋白的表达情况;Western blotting法检测稳定干扰ITGB1后上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志蛋白(E-cadherin,Vimentin,N-cadherin,Fibronectin)的表达情况;利用划痕试实验和Transwell侵袭试实验分别检测稳定干扰ITGB1后细胞的迁移及侵袭能力。Real-time PCR和Western blotting结果显示,shITGB1组细胞ITGB1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于Blank组和shNC组细胞(p0.01,p0.01)。Western blotting结果显示,稳定干扰ITGB1可部分逆转乳腺癌细胞BT549的EMT化;稳定干扰ITGB1后,上皮标志蛋白E-cadherin表达显著上调(p0.01),间质标志蛋白Vimentin(p0.05)、N-cadherin(p0.01)和Fibronectin(p0.01)的表达显著降低。划痕和Transwell侵袭试验实验结果显示,稳定干扰ITGB1后可显著降低乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力(p0.05,p0.05)。在乳腺癌BT549细胞中稳定干扰ITGB1后,通过逆转EMT化抑制细胞迁移和侵袭。     

GJA1在结直肠癌组织中表达及促进侵袭转移的研究

摘要 目的：间隙连接Alpha-1蛋白（Gap Junction Alpha-1,GJA1）是间隙连接中分布最广泛的蛋白,并在多种肿瘤中起促癌作用,但其在结直肠癌发生、发展的作用研究甚少。本实验旨在探究GJA1在结直肠癌组织中的表达情况及其对结直肠癌细胞系侵袭、转移能力的影响,以期为结直肠癌的诊断和预后寻找新的生物标志物。方法：收集92对结直肠癌及其癌旁组织样本,提取组织RNA,利用qRT-PCR检测GJA1相对表达量,并分析GJA1表达与临床病理特征及预后的相关性。在HCT116和HCT8两种结直肠癌细胞系中分别构建GJA1过表达载体和敲减载体,利用qRT-PCR和、Western Blot检测上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相关蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Snail的表达变化,利用Wound healing和Transwell实验观察其迁移、侵袭能力的变化。结果：相对于癌旁组织,GJA1在结直肠癌组织中显著低表达。并且结直肠癌中低表达的GJA1与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴血管转移相关,低表达GJA1结直肠癌患者显示更差的总体生存率和更低的无病生存率。此外,过表达GJA1后,结直肠癌细胞E-cadherin的表达升高,N-cadherin、Vimentin和Snail的表达降低,划痕愈合减慢,Transwell转移细胞减少;而敲减GJA1后,结直肠癌细胞E-Cadherin的表达降低,N-Cadherin、Vimentin和Snail的表达升高,划痕愈合加快,Transwell转移细胞增多。结论：GJA1在结直肠癌中低表达,其表达降低可通过EMT促进结直肠癌的侵袭、转移并影响病人预后。     

CXC趋化因子配体8促进结直肠癌微环境中M2型巨噬细胞趋化及浸润

CXC趋化因子配体8(CXC chemokine ligand 8,CXCL8)在结直肠癌等多种肿瘤中高表达,并促进肿瘤恶性进展。研究发现,结直肠癌微环境中有大量M2型巨噬细胞浸润,但CXCL8是否影响M2型巨噬细胞的浸润及其潜在机制尚未可知。本文旨在探讨CXCL8对结直肠癌中M2型巨噬细胞浸润及趋化作用的影响。本研究首先分析了TCGA数据库结直肠癌样本中CXCL8表达水平及免疫细胞浸润情况,并在临床组织中进行验证。随后Western 印迹及qRT-PCR检测5种结直肠癌细胞株CXCL8的表达情况。佛波酯(PMA)及IL-4诱导THP-1至M2型巨噬细胞后,与HCT116、SW480细胞及过表达CXCL8的HCT116(CXCL8/HCT116)、SW480(CXCL8/SW480)共培养,检测M2型巨噬细胞趋化情况。白细胞介素1β(IL-1β)处理HCT116、SW480细胞,检测CXCL8表达情况,与M2型巨噬细胞共培养,分析趋化结果。结果显示,患者癌组织CXCL8表达高于癌旁组织,CXCL8高表达癌组织中存在更多M2型巨噬细胞浸润;IL-1β作用于HCT116或SW480后,CXCL8的mRNA及蛋白质表达水平升高(P<0.05)。Transwell实验证实,CXCL8趋化M2型巨噬细胞(P<0.05)。综上所述,结直肠癌细胞中CXCL8可由IL-1β诱导产生,CXCL8表达增加能够促进M2型巨噬细胞的趋化,结直肠癌微环境中M2型巨噬细胞大量浸润可能与CXCL8表达升高有关。     

RNAi沉默CXCR7对人结肠癌细胞SW620特异性靶向抑制的实验研究

目的:探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响。方法:(1)设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列,与pSilencerTM4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;(2)将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620,RT-PCR检测CXCR7 mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验表达载体;(3)MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响;(4)通过细胞划痕实验检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响;(5)Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况。结果:(1)测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功,滴度分别为3.16×108TU/ml、4.27×108TU/ml、3.93×108TU/ml和2.95×108TU/ml;(2)3组慢病毒载体转染SW620细胞后,CXCR7 mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低(P0.05),其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组(P0.05);(3)CXCR7-shRNA-1转染SW620后,肿瘤细胞的增殖程度显著减少,与空白组相比有显著性差异(P0.05);(4)SW620细胞在划痕24h后,空白对照组和实验组的细胞迁移指数(MI)分别为(49.92±6.41)%和(29.13±5.38)%,有统计学意义(P0.05),划痕48h后,对照组与实验组的MI分别为(96.52±7.44)%和(72.03±8.29)%,有统计学意义(P0.05);(5)CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量明显降低,具有统计学意义(P0.05)。结论:CXCR7-shRNA慢病毒表达载体转染SW620细胞后可有效下调CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平并能够抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,为下一步研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的结直肠癌慢病毒基因沉默治疗打下了良好的基础,为结直肠癌的基因治疗提供了新方向。