白地霉G38生物转化制备抗忧郁药?-fluoxetine

从200株菌中筛选出具有双酮化合物还原活力较高的菌株7株,其中以白地霉(Geotrickum, sp. )G38活力最高,而且有较好的区域选择性和立体选择性。白地霉G38能对β-羰基苯丙酸乙酯进行不对称还原,生成?-β-羟基苯丙酸乙酯,用于制备抗忧郁药?-fluoxetine。用二甲基硅橡胶包埋白地霉菌体取代游离菌体进行生物转化,可以提高反应的立体选择性,对映体过量值从49％提高到81％。     

（S）-（-）-β-羟基苯丙酸乙酯的微生物法合成

采用酿酒酵母CGMCC No．2266菌体,不对称还原β-羰基苯丙酸乙酯制备光学纯（S）-（-）-β-羟基苯丙酸乙酯。结果表明：采用初始pH为8．0的液体发酵培养基培养的CGMCCNo．2266菌体经过50℃预热处理30min后用于生物转化获得的（S）-（-）-G-羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值可以达到100％ee。确定了合成（S）-（-）-β-羟基苯丙酸乙酯的较佳转化条件为pH7．0,温度30℃,转化时间24h,底物浓度为3．63mmol／L,菌体用量为86g/L（干重／反应体积）。以10％葡萄糖为辅助底物,产率比不加辅助底物时提高了75．4％。在最佳转化条件下反应转化率及（S）-（-）-β-羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值可分别达到98．4％和100％ee。     

Bacillus megaterium WZ009催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯

以外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯为唯一C源的富集培养筛选得到一株菌株WZ009,经16S rDNA测序鉴定为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)。B.megaterium WZ009静息细胞可以立体选择性催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯水解和脱氯反应得到光学纯的(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(e.e.≥99%)和(S)-3-羟基-γ-丁内酯(e.e.≥95%)。笔者对B.megaterium WZ009不对称催化反应影响因素(温度、pH、中和剂、底物浓度、时间进程以及细胞重复利用)进行优化研究,确定了该反应体系最优条件:底物浓度200 mmol/L,中和剂氨水,pH 7.2,40℃反应12 h,转化率达到50.6%,底物对映体过量值为99.6%。该生物催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯过程具有良好的工业化应用前景。     

一株微生物菌株催化水解拆分外消旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯

从土壤中筛选到一株能够拆分外消旋的硫辛酸中间体6-羟基-8-氯辛酸乙酯的微生物菌株T4,并对其拆分反应条件进行了优化,确定了最适反应温度为30℃,最适pH为7．0,最适摇床转速为170r／min,确定了有效表面活性剂为CTAB,在此优化条件下反应8h,得到（R）-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的对映体过量值（e．e．）为92．8％,产率为26．3％。该研究为（R）-硫辛酸的制备提供了一条可行的途径。     

来源于西梅的(R)-醇腈酶促立体选择性转氰合成(R)-酮醇腈

在水/有机溶剂双相反应体系中,研究了来源于西梅的(R)-醇腈酶催化酮与丙酮醇腈合成(R)-酮醇腈的立体选择性转氰反应．系统探讨了不同酶源、酶粉颗粒大小、底物浓度、两底物配比、酶浓度和底物结构对转氰反应的影响．结果发现西梅醇腈酶能高效催化三甲基硅酮与丙酮醇腈的立体选择性转氰．酶粉颗粒大小以直径0.3～0.45 mm为优,底物浓度以21 mmol/L左右为佳,底物丙酮醇腈与三甲基硅酮摩尔浓度比以2∶1为宜,酶浓度以60.9 g/L左右为好．西梅醇腈酶对3, 3-二甲基-2-丁酮几乎没有催化活性,而对其硅结构类似物三甲基硅酮却具有非常高的立体选择性和催化活性,在上述优化反应条件下反应24 h的底物转化率和产物光学纯度均高达99%以上,表明底物中的硅原子对西梅醇腈酶的催化活性有非常显著的促进作用．     

2-氧代-4-苯基丁酸乙酯还原酶产生菌筛选及产酶条件

研究了利用生物催化不对称还原的方法制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯[(R)-HPBE]。以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)为底物,通过对实验室保藏菌株进行筛选,得到一株产物立体选择性较高的菌株G2ndida krusei SW2026,并对其发酵产酶条件进行研究。其最适的发酵培养基组成为4.5%葡萄糖,3%蛋白胨,1.5%牛肉膏,0.05%Mn~(2+);适宜的产酶发酵条件为初始pH 6.0,温度28℃,摇床转速180 r/min,发酵周期48 h。将此条件下发酵培养的菌体用于OPBE的不对称还原反应,产物(R)-HPBE的对映体过量值(e.e.)可达97.33%,产率最高达到72.54%。     

毕赤酵母不对称合成阿托伐他汀中间体

阿托伐他汀可通过抑制HMG-CoA还原酶与底物的结合来抑制胆固醇的合成,而 (R)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚胺基戊酸乙酯是阿托伐他汀合成的重要中间体。通过对实验室保藏菌种进行筛选,得到一株巴氏毕赤酵母X-33可将5-邻苯二甲酰亚胺-3-氧代戊酸乙酯还原为 (R)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚胺基戊酸乙酯。在磷酸盐缓冲液体系中考察了初始底物浓度、反应时间、辅助底物、葡萄糖添加量、pH、温度等因素对产物收率和对映体选择性的影响,获得了较佳的反应条件。选择底物投料量为7 g/L时,当菌体浓度120 g/L,葡萄     

伴有辅酶原位再生的胞外酶耦合法制备（R）-苯基乙二醇

经5轮诱变筛选,从近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis CICC1676）中分离得到产NADH依赖型羰基还原酶（Carbonyl reductase,CR）菌株CP-9。所产羰基还原酶（CRCp-9）经两步快速纯化获得纯化倍数为11．5倍,比活力为1．84 U/mg的酶液,其还原反应的最适pH值为6．5,最适温度为40℃。该酶转化β-羟基苯乙酮制备手性化合物（R）-苯基乙二醇,因此是（R）-专一性羰基还原酶。该酶与NADH普适性再生酶-甲酸脱氢酶（For-mate dehydrogenase,FDH）在胞外相耦联,构建伴有辅酶再生与反复利用的CR/FDH双酶催化制备立体醇体系,底物β-羟基苯乙酮转化率达95．4％,产物（R）-苯基乙二醇得率为93％,辅酶的总转化数（Total turn number, TTN）达267,产物e．e．值为98．6％,批次耦合反应生产能力达0．8 g/L/h,较单酶催化有较大提高,与细胞转化法相比也具有较好的生产能力。因此,伴有辅酶再生的胞外酶耦合催化具有潜在的制备手性醇化合物的工业应用价值。     

白地霉甘油脱氢酶的分离纯化及特性

从15株白地霉菌株中筛选出一株甘油脱氢酶活性和产量最高的菌株.利用Blue-Sepharose CL-4B和DEAE-Sepharose CL-6B两个柱子纯化后甘油脱氢酶达到电泳纯.该酶分子量约为94kD,亚基分子量约为31kD.纯化倍数和回收率分别为14倍和29%.该酶对2位羟基的直链低分子一元醇,二元醇或三元醇都表现出高的氧化活性,对"R型"的2-丁醇、2-戊醇和"S型"的二元醇、β-羟基酯类表现出显著的立体选择性;对2位羰基的直链低分子物质表现出明显的还原活性.     

南海深海微生物酯酶EST12-7在制备(R)-2-氯丙酸乙酯中的应用研究

利用来源南海深海的微生物酯酶EST12-7不对称水解反应拆分制备（R）-2-氯丙酸乙酯。并探寻了温度、pH、底物浓度、有机溶剂和反应时间等因素对酯酶EST12-7催化制备（R）-2-氯丙酸乙酯的影响。结果表明,深海微生物酯酶EST12-7催化制备（R）-2-氯丙酸乙酯的最佳反应条件为：13.8 μg/ml酯酶EST12-7,50 mmol/L（±）-2-氯丙酸乙酯,2%正癸醇,pH8.5,30℃,0.05mol/L Tris-HCl,反应60 min。在最佳反应条件下,（±）-2-氯丙酸乙酯的转化率可达49%,所制备的（R）-2-氯丙酸乙酯的光学纯度为98%。通过对酯酶EST12-7拆分制备（R）-2-氯丙酸甲酯和（R）-2-氯丙酸乙酯进行比较,2-氯丙酸酯中的链长对酯酶EST12-7拆分反应有极大的影响。     

微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究 Ⅰ.高度立体选择性菌株的筛选

从361株细菌和酵母菌中分别筛选到12株可不对称水解布洛芬乙酯生成R(-)-布洛芬的细菌(5株菌对映体过量(ee)可达85%)和15株具有不对称水解布洛芬乙酯活性的酵母菌,其中皮状丝孢酵母T158生成S( )-布洛芬,ee可超过92%.该酵母菌最适碳源为葡萄糖,浓度以1.0—1.5%适宜,蛋白胨浓度低于0.3%或高于0.5%对水解拆分均不利.酵母膏的加入显著提高水解活性,最适浓度0.3%.在培养基中添加表面活性剂吐温80(0.2%)既可提高拆分专一性,又能增强水解能力.     

微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究 Ⅰ.高度立体选择性菌株的筛选

从361株细菌和酵母菌中分别筛选到12株可不对称水解布洛芬乙酯生成R(-)-布洛芬的细菌(5株菌对映体过量(ee)可达85%)和15株具有不对称水解布洛芬乙酯活性的酵母菌,其中皮状丝孢酵母T158生成S(+)-布洛芬,ee可超过92%.该酵母菌最适碳源为葡萄糖,浓度以1.0—1.5%适宜,蛋白胨浓度低于0.3%或高于0.5%对水解拆分均不利.酵母膏的加入显著提高水解活性,最适浓度0.3%.在培养基中添加表面活性剂吐温80(0.2%)既可提高拆分专一性,又能增强水解能力.     

高选择性不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺的重组氧化还原酶催化性质及其酶促转化

【目的】通过表达多种重组立体选择性氧化还原酶,分析其催化不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)的性质,从而构建酶促合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)的反应体系。【方法】基于已有立体选择性氧化还原酶重组大肠杆菌,通过Ni离子亲和层析法纯化得到重组氧化还原酶,以DKTP为底物,考察不同重组氧化还原酶对DKTP的催化活性和选择性,进一步对高选择性酶促合成(S)-DHTP的重组酶CR2进行性质分析,并考察其在最适条件下不对称还原DKTP的过程。【结果】筛选获得产物构型为(S)-型的催化活性最高的酶为CR2,该酶米氏常数Km为0.135 mmol/L,kcat/Km为3.689 L/(mmol·s),最适p H 8.4(0.1 mol/L三乙醇胺缓冲液),最适反应温度为35°C,在10-45°C条件下和p H 7.5-8.5较为稳定,Zn2+离子对酶活有促进作用。CR2催化DKTP不对称还原反应6 h后,DHTP的产率达92.1%、光学纯度达99.9%。【结论】基于活性和选择性分析,获得不对称还原DKTP的目标酶CR2,其催化特性有利于高立体选择性还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP,从而为进一步提高酶促不对称还原DKTP的转化效率提供研究基础。     

酿酒酵母B5不对称还原制备手性药物中间体R-2′-氯-1-苯乙醇的研究

从 11株微生物中筛选出 4株具有不对称还原 2′ 氯 苯乙酮能力的酵母 ,其中酿酒酵母B5的还原产率与对映体选择性最佳。确定了酿酒酵母B5对 2′ 氯 苯乙酮还原的最佳反应时间为 2 4h ;最佳pH 8 0 ;最佳反应温度为2 5℃ ;最佳共底物为 5 % (体积比 )乙醇。同时研究了底物浓度、微生物的量、微生物的培养条件等对反应产率和立体选择性的影响。细胞浓度为 10 75mg mL(细胞干重 反应体积 )的酿酒酵母B5可将 6 47mmol L的 2′ 氯 苯乙酮10 0 %地转化为R 2′ 氯 1 苯乙醇 ,其对映体选择性为 10 0 %。酿酒酵母B5可重复利用的特点可提高产物的产量。     

新型辅酶依赖型立体选择性氧化还原酶性质的初步研究

为了进一步认识立体选择性转化用菌株近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)SYB-1的转化机理及其转化酶系的酶学特性,考察了该菌种来源的粗酶的辅酶依赖型及立体选择性,发现依赖于辅酶NADP ,该酶将(R)-苯基乙二醇氧化为β-羟基苯乙酮;而依赖于辅酶NADH,该酶不对称还原β-羟基苯乙酮为(S)-苯基乙二醇。在研究该粗酶酶学特性后发现该粗酶对5C的伯醇专一性较强;在包括仲醇和二元醇的手性醇中,对于二元醇的专一性较强;而在还原反应中对2-丁酮专一性较强。金属螯合剂及重金属离子会对该粗酶的活力产生抑制作用。该粗酶催化氧化的最适pH为8.0,最适温度为50℃;催化还原的最适pH为6．0,最适温度为40℃。     

高分子膜载体固定化酵母催化2-辛酮不对称还原

以戊二醛交联尼龙6膜载体固定化面包酵母DX213,采用固定化酵母细胞催化2-辛酮不对称还原得到(R)-2-辛醇。系统考察了有机溶剂、反应时间、pH、底物、辅助底物和热处理等因素对反应的产率和光学选择性的影响。结果表明,上述因素对酵母细胞催化不对称合成(R)-2-辛醇反应均有显著影响。二氯甲烷为该反应最适有机溶剂,在固定化细胞57 g/L(50℃预热50 min),水相与有机溶剂相体积比4/1,pH 7.0,初始2-辛酮浓度为60 mmoL/L(分别在反应0,10,17 h等分添加),蔗糖5.7 g/L和28℃条件下反应48 h,(R)-2-辛醇的产率和e.e.值分别达到89.3%和96.8%。     

不对称水解(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯新菌种的分离鉴定及酯酶基因的克隆、表达

【目的】筛选鉴定1株可以选择性水解农药甲霜灵的中间体(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)的菌株,并克隆、表达该菌株中的酯酶基因。【方法】以MAP为唯一碳源,对活性污泥样品中的微生物进行富集培养,采用罗丹明B平板显色法进行初筛,通过摇瓶复筛得到了1株对MAP具有最高对映体选择性和水解活力的新菌株,根据其形态、生理生化特征及16S rRNA序列分析,确立该菌株的系统发育学地位。构建该菌株的基因文库,筛选获得含目的基因的克隆子,通过序列分析和引物扩增得到酯酶基因,将基因与表达载体pET28a(+)连接后,转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)plysS,构建重组菌。【结果】该菌属于革兰氏阴性菌,结合16S rRNA基因、形态特征和生理生化实验结果,鉴定该菌为反硝化无色杆菌。通过基因文库法,找到了该菌中的酯酶基因EHest,并成功构建了重组大肠杆菌EHest-p ET28a(+)-BL21Gold(DE3)plys S,表达了来自Achromobacter denitrificans 1104且具有不对称水解MAP活性的酯酶EHesterase,大小约27 kDa,表达酶活是原始菌株的27.1倍。用EHesterase催化MAP水解,底物浓度50 g/L,反应1 h,底物转化率为29.5%,产物(酸)的ee_p为85.1%,对映体选择性为R型。该酶的最适反应pH和温度分别为pH 9.0和50°C。它水解MAP的活性分别是水解橄榄油和乙酸乙酯活性的333倍和667倍。【结论】筛选到1株具有不对称水解MAP能力的新菌株Achromobacter denitrificans 1104。     

重组猪胰蛋白酶及其R122位点突变体在毕赤酵母中的高效表达及其性质研究

目的:研究R122位点突变重组猪胰蛋白酶,与野生型酶相比较,该位点对重组猪胰蛋白酶(RPT)性质的影响。方法:以毕赤酵母GS115作为表达宿主,对RPT、突变体mRPT(R122H)和 mRPT(R122H/R73G/R130T)进行表达及纯化。并对其性质和稳定进行对比研究。结果:重组胰蛋白酶及其突变体在毕赤酵母中均获得了高效表达。相对于RPT,突变体mRPT(R122H)和 mRPT(R122H/R73G/R130T)在以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 (BAEE)为底物时,具有更强底物结合力,三者的米氏常数分别为18.8μmol/L、9.0μmol/L和11.0μmol/L;两突变体耐高温耐碱能力增强;在Ca ²⁺存在及去除的条件下,突变体具有更强的抗自降解能力。 结论:可以利用毕赤酵母高效表达重组胰蛋白酶及其突变体。mRPT(R122H)和mRPT(R122H/R73G/R130T) 相对于野生型RPT,对高pH条件和高温的耐受性增强,该稳定性的提高主要归因于R122位点的突变。     

羰基还原酶产生菌Candida ontarioensis制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇

从实验室保藏的菌株中筛选获得Candida sp.PT2A,并通过18S rRNA鉴定为安大略假单胞菌Candida on-tarioensis。对C.ontarioensis不对称还原合成(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的发酵产酶条件和转化条件进行优化,确定了最适的发酵产酶条件和转化条件:温度30℃,初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,菌体质量浓度200 g/L。采用2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮质量浓度为10 g/L时,还原反应72 h,(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的e.e.值为99.9%,产率为99%;底物质量浓度提高至30 g/L时,产率下降为84.3%。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对C.ontarioensis细胞进行通透性处理(CTAB g/L,4℃下处理20 min),在30 g/L底物下反应24 h,产物的e.e.和产率分别达到99.9%和97.5%。     

不对称还原前手性芳香酮微生物的筛选及反应特性

含芳香基手性醇是许多手性药物合成的关键手性砌块,生物催化不对称还原前手性酮是合成该类醇的重要方法之一.以4'-氯-苯乙酮为模型底物,从土壤中筛选得到一株能高效催化前手性芳香酮不对称还原合成相应手性醇的菌株,鉴定表明该菌株为白地霉( Geotrichum candid ).进一步考察了其催化4'-氯-苯乙酮不对称还原的反应特性,发现还原4'-氯-苯乙酮的产物主要为 S-4'-氯苯乙醇.在合适的反应条件下,其产率达到35%,对映选择性高于97%.