IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。     

小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。     

TALEN质粒转染HEK-293T细胞的条件优化

本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光细胞,计算绿色荧光细胞/总细胞数的比例得出转染率,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验结果表明,TALEN质粒转染293T细胞,采用Fugene HD转染试剂比Lipofectamine 2000转染试剂细胞存活率高;以6孔板为例,转染质粒DNA量为4μg时转染效率最高(49.0±8.0)%;Fugene HD与质粒DNA比例(μg/μL)为3:1时转染效率最高。本研究建立TALEN表达质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件,可作为相关研究或应用提供参考。     

新型纳米转染试剂转染PNP自杀基因体外杀伤实验

将壳聚糖纳米粒包裹的报告基因pEGFP-N1质粒转染至HEK293细胞,并在HEK293细胞中成功表达荧光蛋白的基础上,进一步将本室自行构建的PNP基因的真核高效表达载体质粒pcDNA3-PNP转染至HEK293细胞。转染72h后,对转染的HEK293细胞给予前体药6-MPDR至终浓度40μg/ml,一天后,采用MTT比色法测定药物对细胞增值的影响,并进行统计学处理。实验结果表明采用壳聚糖纳米粒转染试剂转染并给予前体药6-MPDR的实验组活细胞数,与用壳聚糖转染但不给前体药6-MPDR的对照组活细胞数相比,有显著差异(P<0.05),说明新筛选出的壳聚糖纳米粒转染试剂可以将PNP自杀基因递送至靶细胞中,并在细胞中进行表达,从而使PNP/6-MPDR自杀基因系统发挥杀伤细胞的作用。分别采用相同工作浓度的脂质体与壳聚糖纳米粒转染试剂转染相同浓度的基因质粒,壳聚糖纳米粒对靶细胞生长数量影响很小,说明的壳聚糖纳米粒细胞毒性大大低于阳离子脂质体的细胞毒性。     

解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体的构建

目的:构建解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,为寻找调控UCP1表达的小分子化合物提供有效工具。方法:从小鼠基因组DNA中PCR扩增小鼠UCP1启动子上游2000 bp序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,构建p GL3-UCP1启动子。测序正确后,提取质粒,然后将上述载体与p RL-TK载体共转染至HEK293细胞、小鼠白色脂肪前体细胞和小鼠棕色脂肪前体细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性。结果:通过PCR成功扩增获得了目的片段,并将其克隆至p GL3-basic中。与细胞内源UCP1表达水平相似,荧光素酶报告系统表明构建的p GL3-UCP1在棕色脂肪细胞中启动子活性最高,在白色脂肪细胞中活性较低,在HEK293细胞中基本没有活性。同时β3肾上腺素受体激动剂CL 316,243同样能够上调p GL3-UCP1的启动子活性。结论:成功构建了小鼠UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,并证明在棕色脂肪细胞中,该启动子具有很强的启动子活性,而在白色脂肪和HEK293细胞中,启动子活性很低。该启动子报告系统有望为寻找激活UCP1的小分子化合物提供重要平台。     

一种适于家蚕细胞激素研究的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒的构建（英文）

双荧光素酶报告基因系统能够提供灵敏的读数,但该系统需要依赖组成型表达的内参对读数进行归一化。然而,大多数内参并不是在所有条件下都组成型表达。为此,文中建立了一个有效的方法制备适于家蚕细胞双荧光素酶报告基因系统的内参质粒。首先,突变BmV gP78启动子上的激素应答相关元件,获得了在家蚕细胞中稳定表达的组成型启动子BmV gP78M;然后,用BmV gP78M替换pRL-SV40质粒上的SV40启动子和嵌合内含子序列,成功构建了pRL-V gP78M内参质粒;最后,通过细胞转染实验证实pRL-V gP78M内参在家蚕细胞系中稳定表达,并且pRL-V gP78M内参的表达活性不受蜕皮激素、保幼激素及激素相关转录因子的影响。最终,获得了在家蚕细胞中稳定表达且表达量适中的内参质粒pRL-V gP78M。该内参可以有效地作为双荧光素酶报告基因系统的内参质粒用于家蚕细胞系中激素的研究。同时,该内参质粒的构建方法也为构建适于其他物种细胞系的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒提供了参考。     

一种适于家蚕细胞激素研究的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒的构建

双荧光素酶报告基因系统能够提供灵敏的读数,但该系统需要依赖组成型表达的内参对读数进行归一化。然而,大多数内参并不是在所有条件下都组成型表达。为此,文中建立了一个有效的方法制备适于家蚕细胞双荧光素酶报告基因系统的内参质粒。首先,突变BmV gP78启动子上的激素应答相关元件,获得了在家蚕细胞中稳定表达的组成型启动子BmV gP78M;然后,用BmV gP78M替换pRL-SV40质粒上的SV40启动子和嵌合内含子序列,成功构建了pRL-V gP78M内参质粒;最后,通过细胞转染实验证实pRL-V gP78M内参在家蚕细胞系中稳定表达,并且pRL-V gP78M内参的表达活性不受蜕皮激素、保幼激素及激素相关转录因子的影响。最终,获得了在家蚕细胞中稳定表达且表达量适中的内参质粒pRL-V gP78M。该内参可以有效地作为双荧光素酶报告基因系统的内参质粒用于家蚕细胞系中激素的研究。同时,该内参质粒的构建方法也为构建适于其他物种细胞系的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒提供了参考。     

探讨穿心莲内酯对HIV-1感染辅助受体CXCR4启动子作用机制的研究

穿心莲内酯具有明显的抗病毒作用,对HIV-1(Human immunodeficiency virus type 1)具有明显的抑制作用,本研究探讨了穿心莲内酯影响CXCR4启动子活性的作用机制。首先构建双荧光素酶报告基因载体pFireRlucCXCR4(C-X-C chemokine receptor 4),并转染入人HEK293T细胞;利用CCK8法检测穿心莲内酯对人HEK293T细胞细胞毒性作用;双荧光素酶报告基因技术检测穿心莲内酯对CXCR4启动子活性的影响;MTT法检测穿心莲内酯对人T淋巴细胞Jurkat细胞活性影响;实时荧光定量PCR检测穿心莲内酯对人T淋巴细胞Jurkat细胞表面CXCR4 mRNA和蛋白表达的影响。PCR分别扩增了CXCR4启动子（777 bp）和Rluc(1 997 bp)表达单元,通过测序和酶切鉴定双荧光素酶报告基因载体插入正确;穿心莲内酯作用于转染pFireRluc-CXCR4HEK293T细胞,双荧光素酶结果显示：穿心莲内酯能够下调CXCR4启动子活性,差异具有显著性（P<0.05）。穿心莲内酯作用于人T淋巴细胞Jurkat细胞后,qPCR...     

转录因子AP-2beta和p53蛋白相互作用的研究

转录因子p53与AP-2基因家族成员AP-2beta发生突变后,均会导致个体出现相应的疾病。本文首先利用两个重组质粒p CMV-HA-p53和p Myc-AP-2beta,转染永生化的胚胎肾细胞HEK293(野生型),在细胞中表达相应蛋白质。通过免疫共沉淀实验证明AP-2beta和p53蛋白在体内可以相互作用。并将梯度增加的p MycAP-2beta质粒及等量p CMV-HA-p53质粒转染到HEK293细胞,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验证明AP-2beta能正向调控p53蛋白的表达。为了进一步探讨AP-2beta与p53的作用机制,利用蛋白质合成抑制剂CHX(cycloheximide)处理转染了AP-2beta与p53表达质粒的细胞,实验结果说明,AP-2beta能增加p53蛋白的稳定性来调控p53的表达。     

人p65真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建带Myc标签的人p65真核表达载体,对其在人宫颈癌He La细胞中的定位进行检测,并研究p65对核因子κB(NF-κB)转录活性的影响。方法:构建带Myc标签的p65真核表达载体pc DNA3.1-Myc-p65,质粒测序验证正确后脂质体法瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,Western印迹鉴定p65的表达;细胞免疫荧光实验检测p65的亚细胞定位;重组质粒与NF-κB-Luc报告基因质粒共转染HEK293T细胞,加TNFα刺激后检测萤光素酶报告基因的活性。结果:测序结果证实pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体构建成功;脂质体法转染HEK293T细胞后检测到Myc-p65蛋白的表达;细胞免疫荧光实验显示Myc-p65蛋白定位于He La细胞的细胞质中,当加入TNFα刺激后大部分Myc-p65蛋白进入细胞核;萤光素酶活性检测结果显示,提高细胞内p65水平或加入TNFα刺激均可明显激活NF-κB信号通路的活性。结论:构建了带Myc标签的p65真核表达载体,并使其在HEK293T细胞中表达;正常情况下,Myc-p65蛋白定位于宫颈癌He La细胞的细胞质中,TNFα促进Myc-p65入核;Myc-p65能够以TNFα不依赖的方式激活NF-κB信号通路。pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体的构建,为进一步筛选NF-κB的相互作用蛋白及功能研究奠定了基础。     

稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建

目的构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株。方法PCR扩增获得ALB启动子,并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc—ALB质粒,脂质体转染质粒到不同细胞,ALB—GLuc活性检测功能。构建逆转录病毒,感染HP14．5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株,经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB—GLuc检测荧光素酶活性,免疫荧光检测ALB的表达。结果PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游,HEK293、HP14．5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB—GLuc活性与免疫荧光结果一致。HP14．5ALB—Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活,免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强,并与ALB—Gluc活性升高一致。结论成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株,为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段。     

LipofectAMINE2000与Fugene6转染细胞的效率比较

目的:比较LipofectAMINE2000与Fugene6转染细胞的效果。方法:将含有Firefly和Renilla荧光素酶基因的质粒分别用LipofectAMINE2000和Fugene6转染293T、HepG2和DLD-1细胞,于48h后裂解细胞测定荧光素酶活性。结果:在293T细胞中,LipofectAMINE2000转染组的萤火虫(Firefly)和Renilla荧光素酶活性分别是Fugene6转染组的6.5和5.6倍(P<0.005);在HepG2细胞中,LipofectAMINE2000转染组的Firefly和Renilla荧光素酶活性分别是Fugene6转染组的44和49倍(P<0.001);而在DLD-1细胞中,两者无差别。结论:转染试剂LipofectAMINE2000和Fugene6对不同细胞的转染效果存在差异,当进行转染实验时,对于不同的细胞须根据情况进行选择。     

miR-126报告基因载体的构建及其功能鉴定

目的:根据miR-126的预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒,并进行功能鉴定。方法:利用sanger数据库提供的miR-126靶序列设计引物,PCR扩增目的微小RNA(microRNAs,miRNAs)靶基因3'非编码区(three-prime untranslated regions,3'UTRs)序列,PCR产物双酶切,后连入经过同样双酶切的pGL3-control载体中,连接产物转化大肠杆菌DH5α,进行阳性克隆鉴定。同样,将候选靶基因3'UTRs突变,突变型3'UTR克隆入pGL3-control报告载体,构建野生型和突变型的报告基因重组质粒。将野生型和突变型的报告基因载体分别和化学合成的microRNA以及内参质粒共转染293TN细胞,进行双荧光素酶检测。结果:成功构建miR-126报告基因野生型和突变型重组质粒pGL3-VEGF-A-3'UTR和pGL3-VEGF-A-3'UTR,质粒测序及酶切结果完全正确。瞬时转染实验显示,过表达miR-126能直接抑制VEGF-A-3'UTRs报告基因活性。结论:miR-126对VEGF-A具有靶向调节功能。     

FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性 FLT-1 启动子的真核表达栽体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力.方法:采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293 细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性.结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc栽体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞(P<0.01),而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达.结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源.     

FLT-1启动子在血管内皮细胞中特异生物活性的检测及其意义

目的:构建带有组织特异性FLT-1启动子的真核表达载体,检测其在转染的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中对荧光素酶报告基因表达的驱动能力。方法：采用PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性。 结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc载体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,双荧光报告系统检测显示,转染的HUVEC细胞其荧光素酶活性明显高于HEK293细胞（P<0.01）,而转染的HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达。结论:克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,可作为血管疾病靶向基因治疗的启动子来源。图     

小鼠组蛋白H3K4甲基化酶Smyd3启动子荧光素酶报告载体的构建与活性分析

为研究小鼠(Mus musculus)组蛋白H3 K4甲基化酶基因Smyd3转录调控的分子机制,本研究首先通过PCR的方法克隆了5条不同长度的Smyd3启动子5’端缺失片段,与pMD19-T载体连接后,双酶切克隆入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,构建Smyd3启动子-pGL3-Basic报告基因重组质粒,瞬时转染HEK293细胞48 h后采用双报告基因检测试剂盒检测Smyd3启动子各缺失片段的相对荧光活性.结果表明,本研究成功构建Smyd3启动子5’端缺失片段-pGL3-Basic荧光报告基因重组质粒,所构建的启动子重组子转染组与阳性对照组相比表现出荧光活性,并且pGL3-Smyd3-4的荧光活性最强,是其他的2至4倍左右,pGL3-Smyd3-5的荧光活性最弱.本研究初步确定Smyd3基因的启动子核心区域可能位于-533～-42bp之间,在-2026～-533 bp之间可能存在启动子负调控序列.     

三种试剂转染293T细胞的效率及毒性比较

该文旨在比较不同的转染试剂介导两种荧光素酶报告基因转染人胚肾细胞293T的效果。采用脂质体转染试剂Lipofectamine~? 2000、非脂质体成分X-tremeGENE HP DNA和FuGENE~? HD转染试剂,选取不同配比的质粒DNA和转染试剂分别将含有绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)的质粒转入293T细胞中,应用倒置荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,锥虫蓝染色法检测细胞存活率。X-tremeGENE HP DNA转染试剂转染293T细胞的效率最高,不管目的基因、质粒DNA和转染试剂的配比如何,其转染效率均显著高于脂质体转染试剂(P均0.05);在相同的质粒DNA和转染试剂比例下,FuGENE~? HD试剂介导GFP转染的效率显著高于脂质体试剂Lipofectamine~? 2000(P均0.05),但二者介导RFP转染的效率无显著性差异(P均0.05);在质粒DNA和转染试剂比为1?2时,X-tremeGENE HP DNA试剂转染GFP和RFP的效率均显著高于FuGENE~? HD试剂(P均0.05),当比例递变为1?4时,二者的转染效率无显著性差异(P均0.05)。随着转染试剂使用量的增多,Lipofectamine~? 2000和FuGENE~? HD试剂的转染效率明显升高,而X-tremeGENE HP DNA试剂的转染效率则下降。与转染GFP基因相比,三种试剂的转染效率均随着目的基因RFP片段的增大而显著降低(P均0.05)。在质粒DNA和转染试剂的比例相同的情况下,三种试剂转染后的存活率无显著性差异(P均0.05),但随着转染试剂用量的增加,三种试剂转染后的细胞存活率均显著降低(P均0.05)。目的基因大小与转染效率成反比,综合考虑转染试剂用量、转染效率和细胞活性,该研究认为X-tremeGENE HP DNA转染试剂效果最好。     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因, 研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区, 并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后, RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA, 然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497— –688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录, 即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。     

人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T细胞中的亚细胞定位及转录活性分析

为了观察人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析它们在HEK-293T细胞中的转录活性差异,将SMAD4全长及剪接体的pEGFP-C1重组质粒转染至HEK-293T细胞中,在荧光显微镜下观察含GFP标签的SMAD4全长及其剪接体蛋白的亚细胞定位,并通过双荧光素报告酶实验在HEK-293T细胞中对SMAD4全长及其剪接体激活SBE报告基因的情况进行比较。亚细胞定位观察显示,与pEGFP-C1空载组中GFP在HEK-293T中呈现核质均匀分布不同, GFP-SMAD4和GFP-SMAD4△4、GFP-SMAD4△6、GFP-SMAD4△5-6、GFP-SMAD4△4-6、GFP-SMAD4△4-7五种剪接体均分布于HEK-293T的细胞质中;而GFP-SMAD4△3则主要分布于HEK-293T的细胞核中。双荧光素酶实验结果显示,与空载组相比,在6种剪接体过表达组中,只有SMAD4△3过表达组能对SBE报告基因的荧光素酶活性起到一定的上调作用;但与SMAD4△3过表达组比较, SMAD4全长过表达组能对SBE报告基因的荧光素酶活性起到更明显的上调作用。本文观察了人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析了其对下游信号通路的转录激活情况,可为后续SMAD4剪接体蛋白的功能研究提供一定的基础。