乳酸乳球菌食品级表达载体的研究进展

乳酸乳球菌（L.lactis）是乳球菌属中最重要和最典型的一个种,在食品工业中应用广泛,被公认为安全的（generally regards as safe,GRAS）食品级微生物。以乳酸乳球菌作为宿主菌,构建表达载体用来表达异源蛋白和酶,逐渐成为食品工业、生物制药和疫苗研究的热点。近年来,乳酸乳球菌的分子微生物学研究取得了重大进展,这为表达载体的构建奠定了基础,一些具有不同用途的乳酸乳球菌基因表达载体已经构建,用来表达抗原蛋白、细胞因子和生物酶等。其中,以来源于食品级微生物的DNA片段构建的食品级表达载体引起人们的关注。     

乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递抗原的研究进展

乳酸菌是人和动物肠道内的常见细菌,被公认为安全级(generally recognized as safe,GRAS)微生物。近年来,对于乳酸菌作为宿主菌表达外源蛋白或抗原的研究取得了一定进展。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是乳酸菌的代表菌种,以其生长迅速、易于操作等优点成为表达外源抗原,作为黏膜免疫活载体疫苗的理想菌株。随着对乳酸乳球菌基因工程的研究逐渐深入,已发展了一系列组成型和诱导型乳酸乳球菌表达系统以及蛋白定位系统。破伤风毒素片段C、布氏杆菌L7/L12蛋白等多种病原微生物抗原已成功在乳酸乳球菌中表达,并已证明部分重组乳酸乳球菌作为黏膜免疫疫苗可以同时刺激局部黏膜免疫应答和系统免疫应答。目前,如何使活载体乳酸乳球菌以最佳方式向黏膜免疫系统提呈抗原继而诱导有效免疫反应是该领域的研究热点,也是巨大挑战。实现外源抗原在乳酸乳球菌中的准确定位及与细胞因子的共表达是未来研究的重要方向之一。乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递外源抗原具有广阔的应用前景。     

乳酸乳球菌表达系统的发展现状与前景展望

乳酸乳球菌作为全球公认安全的微生物,具有多种益生作用,常被用作基因工程宿主菌.在过去的二十年中,乳酸乳球菌作为载体在递呈病毒、细菌抗原等方面得到了广泛的应用,并且在不同领域发挥着重要作用.本文以乳链菌肽控制的表达(nisin-controlled expression,NICE)系统为例,介绍了基于乳酸乳球菌的表达系统...     

重组乳酸乳球菌表达禽流感病毒HA1基因载体的构建及在禽流感病毒防治领域的应用

目的构建以重组乳酸乳球菌为基础的黏膜输送载体。方法以高致病性禽流感病毒H5N1的HA1基因作为研究对象,利用nisin诱导表达控制系统,构建分泌型与非分泌型重组乳酸乳球菌表达载体,经口服灌胃途径免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测小鼠血清IgG和粪便IgA,最后,对免疫后的小鼠进行H5N1病毒攻击实验,进而比较分泌型与非分泌型重组乳酸乳球菌表达载体的免疫效率。结果分泌型重组乳酸乳球菌免疫小鼠后产生的抗体水平（IgG和IgA）高于非分泌型重组乳酸乳球菌,经过同型H5N1病毒攻击后,分泌型重组乳酸乳球菌免疫的小鼠的存活率为80%,而非分泌型重组乳酸乳球菌免疫的小鼠的存活率为60%。结论本研究为防治高致病性禽流感病毒提供可行的思路与方法。     

海藻酸钙微囊对乳酸乳球菌在胃肠道环境中的保护作用

乳酸菌是机体内一类重要的益生菌,因其益生功能和安全性,在食品行业和医疗保健领域有着广泛的应用,此外将乳酸菌作为口服疫苗载体或药物传递载体也是目前的研究热点之一。乳酸菌到达肠道的活菌数是影响其功能有效性的一个重要因素,需考虑为其提供一定的防护来抵御胃酸等恶劣环境。通过化学法制备能稳定表达Gfp的乳酸乳球菌海藻酸钙微囊,以Gfp作为活菌标记,检测了海藻酸钙微囊对乳酸乳球菌的保护作用。体外实验结果显示,酸处理30、60、90、120 min后,海藻酸钙微囊包裹使乳酸乳球菌的存活率分别提高了1 370、525、235和105倍。动物体内实验也表明,在灌胃2 h后,海藻酸钙微囊包裹使乳酸乳球菌在肠道内的活菌数增加90多倍。上述结果说明海藻酸钙微囊对乳酸乳球菌在胃肠道环境中具有明显的保护作用,为今后乳酸乳球菌口服制剂的研究及开发提供重要的参考依据。     

乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达

以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H。首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-TpepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48。然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H。利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在乳酸菌中的表达

目的：构建猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的细胞内表达重组乳酸乳球菌,确定其最佳表达条件,为重组乳酸菌作为口服疫苗防治猪传染性胃肠炎奠定基础。方法：根据猪传染性胃肠炎病毒纤突（S）蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR,获得含有TGEV S基因4个主要抗原位点的约2000bp目的片段,将其与表达载体质粒pNZ8048进行连接,通过电转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,在乳链菌肽（Nisin）的诱导下进行表达,确定最佳表达条件;并通过SDS-PAGE进行检测和Western-blot分析表达蛋白活性。结果：成功获得了TGEV S蛋白在乳酸乳球菌细胞内的表达并且表达的蛋白具有TGE全病毒的抗原性。确定了乳酸乳球菌表达TGEV S蛋白的最佳表达条件为在以1ng/ml的乳链杆菌肽nisin诱导下,诱导后3h,重组蛋白表达效率达最高,重组蛋白约占菌体总蛋白含量的8．7％。结论：在乳酸乳球菌细胞内表达的重组TGEV S蛋白获得了理想表达,为进一步研制开发防治TGE口服疫苗提供物质基础。     

乳酸乳球菌载体疫苗

乳酸乳球菌是一种在食品工业中广泛应用的安全级微生物,应用基因工程手段能使乳酸乳球菌表达多种病毒、细菌、寄生虫的外源蛋白。乳酸乳球菌可经粘膜途径免疫,能有效递呈抗原,诱导外源蛋白的特异性免疫应答,并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫,因此可作为潜在的疫苗载体。本文对乳酸乳球菌载体疫苗的优势、应用以及疫苗设计时需要考虑的问题进行了概述。     

牛凝乳酶原基因在乳酸乳球菌中的表达

【目的】利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the NIsin Controlled gene Expression system,NICE)表达牛凝乳酶原。【方法】从克隆载体pS19-PPC中获得牛凝乳酶原基因,将该基因与表达载体pNZ8148连接并电转化乳酸乳球菌NZ9000,转化子经酶切、PCR和测序鉴定后,用nisin进行诱导表达,表达产物利用SDS-PAGE和Western blot鉴定,表达产物纯化后检测凝乳活性。【结果】重组牛凝乳酶原与天然牛凝乳酶原比较,其分子量大小、免疫性质、生物活性和抑制剂敏感性没有发现显著差异,其凝乳活性可达2×103IMCU/mL。【结论】在乳酸乳球菌中表达了具有凝乳活性的牛凝乳酶原,同时乳酸乳球菌作为发酵剂和凝乳酶产生菌双重角色的实现,为奶酪加工提供了新思路和新方法。     

高产双乙酰乳球菌的研究进展

双乙酰是乳制品中一种重要的风味物质。大多数乳酸茵（如乳球菌）都可以发酵葡萄糖和柠檬酸产生双乙酰。描述了在乳球菌中从柠檬酸代谢和糖酵解途径来生成双乙酰的代谢途径,以及利用基因工程和代谢工程技术来提高乳球菌的双乙酰生成量的策略。     

表达空肠弯曲菌CfrA蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其免疫效果北大核心CSCD

【目的】本试验将空肠弯曲菌肠菌素受体蛋白CfrA编码基因导入食品级乳酸乳球菌表达系统,然后将重组乳酸乳球菌口服免疫鸡,降低空肠弯曲菌在鸡肠道中的定殖。【方法】利用PCR分别扩增空肠弯曲菌cfrA全基因及其N端片段,插入食品级表达载体pNZ8149多克隆位点并转化乳酸乳球菌NZ3900,通过Western blot鉴定重组菌株CfrA蛋白表达情况,同时通过筛选nisin浓度、温度、时间等诱导条件优化重组蛋白表达水平;进而将重组乳酸乳球菌经口服免疫SPF鸡,免疫后分别测定乳酸乳球菌自鸡体内的排出情况、以及诱导CfrA血清抗体和粘膜抗体水平,最后将空肠弯曲菌口服攻毒免疫后的鸡,通过测定鸡泄殖腔棉拭子中空肠弯曲菌的数目来判定口服免疫效果。【结果】Western blot检测显示CfrA全基因及其N端片段均可在重组乳酸乳球菌胞内可溶性表达,不分泌,筛选的最佳诱导表达条件为nisin浓度25 ng/mL、温度37°C、时间1 h。口服乳酸乳球菌10 d内自鸡体完全排空;鸡口服免疫后可产生CfrA蛋白特异性的血清IgG和肠粘膜sIgA抗体;重组乳酸乳球菌口服免疫后空肠弯曲菌在鸡体内的增殖速度显著低于对照组。【结论】成功构建了重组CfrA蛋白的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统;表达CfrA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫鸡对空肠弯曲菌在鸡肠道的定殖具有一定的抑制作用,为研制重组乳酸菌口服家禽免疫制剂防治空肠弯曲菌奠定了基础。     

基于冰核蛋白的乳酸菌表面展示系统的构建

[目的]验证来源于丁香假单胞菌的冰核蛋白在乳酸乳球菌表面展示外源蛋白的可能性.[方法]以绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)基因gfp为报告基因,以冰核蛋白基因的N末端和NC端作为展示单元,构建乳酸菌表面展示载体pHZ101和pHZ102,并转化大肠杆菌(Escherichia coli JM109和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363.[结果]荧光显微镜观察显示重组大肠杆菌和乳酸乳球菌均能检测到绿色荧光.Western blot结果表明GFP蛋白在重组大肠杆菌和乳酸乳球菌中均得到表达,并且INPN-GFP蛋白多数滞留于乳酸乳球菌细胞质内,而INPNC-GFP蛋白则大部分定位于乳酸乳球菌的细胞膜上.[结论]以上结果表明丁香假单胞菌的冰核蛋白能引导外源蛋白定位于乳酸乳球菌的细胞膜上,为乳酸菌表面展示系统的构建提供了新的方向.     

欧芹苯丙氨酸脱氨酶cDNA在乳酸乳球菌中的表达研究

将欧芹（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍｃｒｉｓｐｕｍ）苯丙氨酸脱氨酶（ＰＡＬ）ｃＤＮＡ亚克隆到组成型表达载体ｐＭＧ３６ｅ启动子Ｐ３２下游,电穿孔法转化乳酸乳球菌,获得有ＰＡＬ表达活性的乳酸乳球菌工程菌（ｐＭＧ３６ｅＰＡＬ／Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３）。通过递归ＰＣＲ合成了一段１２０ｂｐ的调控片段,用以将ｐＭＧ３６ｅ改造为分泌型表达载体ｐＸＨＳ,以翻译偶联的方式表达ＰＡＬ,可使ＰＡＬ的Ｎ末端带上ｕｓｐ４５信号肽,结果亦检测到ＰＡＬ酶活性。自行分离克隆了乳酸乳球菌热休克蛋白基因ｄｎａＪ的启动子区域,构建了热诱导表达载体ｐＸＨＪ,获得ＰＡＬ热诱导表达工程菌（ｐＸＨＪＰＡＬ／Ｌ．ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３）,经３０℃至３７℃热诱导,可使ＰＡＬ表达活性提高至２倍。本文还就乳酸乳球菌ＰＡＬ工程菌在经典型苯丙酮尿症防治中的应用进行了分析和讨论     

食品级乳酸乳球菌pNZ8149-luc质粒的构建及表达

目的:构建能够稳定表达萤火虫荧光素酶报告基因(luc)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, L.lactis)食品级表达系统,以便后续研究对目的基因进行示踪。方法:从pGL4.10质粒中PCR扩增萤火虫荧光素酶报告基因,测序,克隆至载体pNZ8149,构建pNZ8149-luc表达质粒;电击转化宿主乳酸乳球菌NZ3900,采用乳糖筛选法获得重组的乳酸乳球菌,Nisin诱导,采用微孔板发光检测仪检测荧光素酶的存在,Western Blot检测目标蛋白luc的表达。结果:PCR扩增的荧光素酶报告基因成功克隆至pNZ8149质粒,并电击转化宿主乳酸乳球菌NZ3900,得到乳酸乳球菌表达系统NZ3900/pNZ8149-luc。Nisin诱导后,检测到荧光素酶随诱导时间的延长活性逐渐增强,时间超过24 h之后荧光素酶活性逐渐下降。Western Blot检测到目标蛋白luc在胞内表达。结论:成功构建了p NZ8149-luc表达载体,并能够在乳酸乳球菌体内稳定表达。     

乳酸乳球菌表面表达Brazzein甜味蛋白系统的建立

参照甜味蛋白Brazzein基因序列,结合乳酸乳球菌的密码子偏嗜性的相关分析,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,将第29位天冬氨酸、31位的组氨酸和第41位的谷氨酸分别突变为赖氨酸、丙氨酸和赖氨酸,以期提高目的蛋白的甜度。采用重叠PCR的方法合成目的基因,目的片段亚克隆到pMD18-T载体上。经序列测定分析后,目的片段克隆入分泌表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌中,构建成表面展示表达甜味蛋白Brazzein的乳酸乳球菌表达系统。     

乳酸乳球菌表面表达Brazzein甜味蛋白系统的建立北大核心CSCD

参照甜味蛋白Brazzein基因序列,结合乳酸乳球菌的密码子偏嗜性的相关分析,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,将第29位天冬氨酸、31位的组氨酸和第41位的谷氨酸分别突变为赖氨酸、丙氨酸和赖氨酸,以期提高目的蛋白的甜度。采用重叠PCR的方法合成目的基因,目的片段亚克隆到pMD18-T载体上。经序列测定分析后,目的片段克隆入分泌表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌中,构建成表面展示表达甜味蛋白Brazzein的乳酸乳球菌表达系统。     

食品级分泌表达载体的构建及报告蛋白在乳酸乳球菌中的表达

为构建乳酸乳球菌食品级分泌表达载体,通过PCR扩增质粒pMG36e的p32启动子片段及乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白(Usp45)基因的核糖体结合位点、分泌信号肽和成熟肽前11个氨基酸的编码序列(SPusp45),克隆到食品级载体pSH91中,构建食品级分泌性表达载体pSQ;克隆报告基因金黄色葡萄球菌核酸酶(NucA)成熟肽的编码序列nucA到pSQ中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MBP71,构建了乳酸乳球菌食品级分泌性表达系统L lactis/pSQ-nucA;通过TB-D法和酶谱法检测L lactis/pSQ-nucA的表达形式、表达量并与以前构建的L lactis/pSQZ-nucA系统表达能力进行比较,结果发现L lactis/pSQ-nucA能够分泌性表达NucA,分泌性表达的NucA量大约是胞内NucA的10倍;L lactis/pSQ-nucA的表达量高于lactis/pSQZ-nucA.为进一步目的蛋白的的分泌性表达及食品级疫苗的研制奠定了基础.     

作为宿主系统的几株乳酸菌的表型特征

目的：研究乳酸菌载体－宿主系统。方法：采用涂片染色和形态特征观察,用鉴别生化实验如过氧化氢酶实验,碳水化合物发酵产酸实验,精氨酸水解实验及抗生素抗性实验等对含有pMG36e质粒的乳酸菌MG1363,乳球菌IL1403和乳杆菌ATCC4356进行研究鉴定。结果：乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363,乳酸乳球菌乳酸亚种IL1403含有质粒pMG36e的MG1363致及嗜酸乳杆菌ATCC4356其表型特征分别与伯杰氏手册中相应细菌特征一致,质粒pMG36e含有红霉素抗性基因,结论：此乳酸菌宿主一载体系统可用载体来源的红霉素抗性进行筛选,用于外源基因在乳酸菌中克隆和表达的研究。     

一株具有谷胱甘肽合成能力的乳酸乳球菌的分离与初步研究

基于gshB基因同源性分析设计引物,从采集的菜园地土壤中分离到1株具有谷胱甘肽(GSH)合成能力的乳酸乳球菌菌株CCSYU10100。测定了该菌株的16S rDNA序列并根据16S rDNA序列构建了系统发育树,结果显示该菌株与乳酸乳球菌乳脂亚种在进化关系上的地位最近。电镜分析表明,菌株CCSYU10100与乳酸乳球菌的形态特征基本一致。因此认为菌株CCSYU10100属于乳酸乳球菌乳脂亚种,命名为乳酸乳球菌乳脂亚种CCSYU10100。HPLC法鉴定出该菌株胞内除GSH外,还存在半胱氨酸-甘氨酸。乳酸乳球菌CCSYU10100的部分gshB基因与假单胞菌属的gshB基因高度同源,这是gshB基因在乳酸乳球菌中、甚至是革兰氏阳性菌中的首次发现。     

乙醛脱氢酶在乳酸乳球菌中的表达与纯化

目的:在乳酸乳球菌中重组表达乙醛脱氢酶(ALDH)。方法:合成毕赤酵母ALDH基因,PCR扩增后通过重组构建pNZ8048-ALDH表达载体,电转至乳酸乳球菌NZ9000感受态,Nisin诱导表达后经Ni柱亲和层析纯化ALDH蛋白,比色法测定酶活。结果:构建了pNZ8048-ALDH表达载体,在乳酸乳球菌NZ9000中实现了ALDH的重组表达,目的蛋白占全菌蛋白的17.2%,其中可溶性表达比例为53%,重组菌株ALDH活力为0.638 U/mL,亲和层析纯化蛋白纯度约70%,比活为0.48 U/mg。结论:在乳酸乳球菌中表达并纯化获得了有活性的ALDH。