连续三步‘Gap-repair’构建小鼠WAP—人LF杂合基因座

为了构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人乳铁蛋白(hLF)基因组序列在乳腺特异性高效表达的mWAP-hLF杂合基因座,我们采用了连续三步‘Gap-repair'的方法.首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行三次gap-repair的基因抓捕载体.然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的gap-repair技术,第一步从含mWAP基因座的细菌人工染色体(mWAP BAC)上亚克隆了8 kb的mWAP基因3'端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从hLF BAC上亚克隆29 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLF基因组序列;第三步,从mWAP BAC上亚克隆12 kb的mWAP基因5'端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个全长约49 kb的mWAP.hLF杂合基因座.经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,我们构建的这个杂合基因座,达到了原来mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hLF基因组序列精确置换的目的.这种连续三步gap-repair构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,将为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法.     

人t-PA突变体cDNA打靶敲入小鼠ES细胞β-酪蛋白位点的研究

应用克隆的基因组序列作为同源臂 ,构建了小鼠 β 酪蛋白基因定位敲入打靶载体。短臂长 2 7kb ,包括小鼠 β 酪蛋白基因 5′端侧翼区、第 1外显子、第 1内含子、部分第 2外显子。长臂包括小鼠 β 酪蛋白基因部分第 2内含子、第 3～ 7外显子、第 3～ 6内含子、部分第 7内含子 ,长 3 4kb。人t PA突变体cDNA在第 2外显子中与小鼠 β 酪蛋白信号肽序列融合。正筛选标记neo放置在 β 酪蛋白基因第 2内含子中部 ,负筛选标记tk位于短臂外侧。ES细胞株TC 1在滋养层上培养扩增。处理ES细胞使其密度达到 2× 10 7个 /mL后 ,将 4 5 μg线性化的打靶载体DNA与 1mL细胞混匀后电击。转染的细胞在含G4 18和Gancyclovir的选择培养基中培养 ,7d后挑取 192个抗性克隆 ,扩增、提取基因组DNA ,EcoRⅠ酶切后 ,用打靶载体 5′端内侧探针进行Southern杂交 ,野生型出现 9 8kb ,而中靶的 β 酪蛋白基因由于敲入的人t PA突变体携带一个EcoRⅠ位点 ,中靶等位基因出现 6 6kb。从 78株ES细胞株中获得 1株发生正确同源重组的中靶ES细胞。     

牛β-酪蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建

利用PCR技术分3段克隆了长约9．7kb的牛β-酪蛋白基因,分别克隆在pGEM-T easy Vector的T位点。经NCBI Blastn分析,与牛β-酪蛋白基因相应区段的同源性为98％。这3段序列包含完整的5’侧翼序列、前8个外显子及第8个内含子的部分序列。以此构建了两个乳腺特异性表达载体：利用第1段和第2段共有的酶切位点将两段融合,作为5’调控区（6．8kb）,第3段和实验室已有的600bp的加尾信号通过重组PCR拼接作为3’调控区（3．4kb）构建了一乳腺特异性表达载体;以第一段作为5’调控区,实验室已有的600bp加尾信号作为3’为调控区构建了另一乳腺特异性表达载体。可以应用于进一步乳腺生物反应器的研制。     

山羊β-casein位点打靶载体在乳腺上皮细胞中的表达研究

以本地山羊基因组DNA为模板,通过长链PCR扩增出山羊β-casein上游包括启动子,外显子1及部分外显子2的6.1kb的调控序列及下游3.3kb的序列,将来自质粒pCDNA3的neo基因以及来自质粒pNEOZTK-2的tk基因,经克隆重组后构建了本地山羊乳腺特异性定点打靶载体,并在其中克隆人乳铁蛋白mini基因,采用脂质体法转染小鼠乳腺上皮癌化细胞系C127,以进行打靶载体的表达功能检测,双夹心ELISA测得诱导液中乳铁蛋白表达量为0.2μg/mL,Western-blot显示重组蛋白分子量比标准品略小,约为76kD,结果说明本载体能够指导外源基因在动物乳腺细胞内正确表达。     

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子IX

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(human clotting factor IX,hFIX)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子l、内含子1、外显子2共约6.7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子l的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠(9♀,3♂),整合率为11.2%.经EuSA和western b1ot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%.FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上.结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFIX的生物活性.     

转基因动物乳腺暂时性表达系统的建立

以乳清酸蛋白(WAP)基因5′区为调控序列,人基因组G-CSF基因为目的片段,同时将WAP基因第一内含子插入G-CSF基因5′端,构建成转基因动物乳腺表达载体。将其直接注射到小鼠乳腺,在泌乳期表达出人G-CSF。表明乳腺直接注射质粒的方法可以做为暂时性的一种表达系统,同时也表明内含子对表达有一定的作用。     

鸡卵清蛋白基因第一内含子和3′-调控区对外源基因表达的调控作用

探明鸡卵清蛋白基因(ov)第一内含子和3′-调控区对目的基因表达水平的影响, 为鸡输卵管表达载体的构建提供科学依据。用牛生长激素基因(BGH)poly A序列替换鸡输卵管表达载体中ov 3′-调控区, 用限制酶消化法逐步删减第一内含子序列, 获得5个表达人组织激肽释放(hK1)cDNA的鸡输卵管表达载体, 分别命名为pOV2K、pOV3K、pOV4K、pOV5K和pOV6K。经翅静脉给产蛋鸡注射聚乙烯亚胺包裹的相同拷贝数重组载体, 通过蛋清中酶活性定量检测评价不同载体的表达水平。结果表明: 受控于3.0kb ov 5′-和3′-调控区的pOV2K表达的重组酶活性明显高于用BGH poly A 替换3′-调控区的pOV3K; 无内含子的pOV6K表达水平显著低于含不同长度第一内含子的pOV3K、pOV4K和pOV5K, 重组酶表达水平随第一内含子的缩短呈逐渐下降趋势。该试验结果表明ov第一内含子和3′-调控区对目的基因在鸡输卵管细胞中的表达具有正调节作用, 应当包括在鸡输卵管表达载体中。     

青鳉p53基因克隆、结构分析及同源重组载体构建

应用“Long PCR”技术 ,用 6对 p5 3引物从青胚胎干细胞基因组DNA中扩增出 6个相互重叠的片段 ,其中最大的片段长达 4 5kb ,这 6个PCR片段覆盖了整个 p5 3基因。序列分析表明青p5 3基因长约 8 7kb ,由 11个外显子和 10个内含子组成。结构比较表明 ,青 p5 3基因在大小上与人和小鼠 p5 3基因存在较大差异。青p5 3基因的内含子 1仅为 0 85kb ,而人和小鼠p5 3基因的内含子 1则分别长达 10kb和 6kb ;青 p5 3基因的外显子 3(86bp)明显大于人和小鼠 p5 3基因的外显子 3(2 2bp) ;外显子 4 (170bp)比人 (2 80bp)和小鼠 (2 6 0bp)的外显子 4小 ;内含子 10 (3 5kb)则比人和小鼠内含子 10 (0 7kb和 0 9kb)大得多。用SVTK neo基因作正选择标记基因 ,用SVTK tk基因作负选择标记基因 ,用青 p5 3基因组片段作同源序列 ,构建了鱼类 p5 3基因同源重组载体。将此载体转染青胚胎干细胞 ,并经G4 18和Ganc药物选择后证明上述正、负选择标记基因在干细胞中能够有效表达 ,并提供对G4 18的抗性和对Ganc的敏感性。     

猪α-1,3-半乳糖转移酶基因打靶载体的构建

目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaⅠ和ClaⅠ位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3'端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotⅠ位点插入该质粒中neo基因的5'端;2.7kb的负筛选标记tk基因位于载体中同源短臂的3'端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。     

山羊β—酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子Ⅸ（human clotting factor Ⅸ,hFⅨ)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子1、内含子1、外显孔子2共约6.7kb片段以及hFLX全长cDNA序列和部分经改造的内含子1的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠（9♂,3♀）,整合率为11.2%,经ELISA和Western blot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFⅨ的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%,FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合小鼠的不同染色体上,结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFⅨ基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFⅨ的生物活性。     

In vitro evaluation of a mammary gland specific expression vector encoding recombinant human lysozyme for development of transgenic dairy goat embryos

A vector expressing human lysozyme (pBC1-hLYZ-GFP-Neo) was evaluated for gene and protein expression following liposome-mediated transformation of C-127 mouse mammary cancer cells. Cultures of G418-resistant clones were harvested 24-72 h after induction with prolactin, insulin and hydrocortisone. Target gene expression was analyzed by RT-PCR and Western blot and recombinant human lysozyme (rhLYZ) bacteriostatic activity was also evaluated. The hLYZ gene was correctly transcribed and translated in C-127 cells and hLYZ inhibited gram-positive bacterial growth, indicating the potential of this expression vector for development of a mammary gland bioreactor in goats. Guanzhong dairy goat skin fibroblasts transfected with pBC1-hLYZ-GFP-Neo were used to construct a goat embryo transgenically expressing rhLYZ by somatic nuclear transplantation with a blastocyst rate of 9.0 ± 2.8 %. These data establish the basis for cultivation of mastitis-resistant hLYZ transgenic goats.     

抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器的制备与验证

目的:构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体并制备和验证抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型。方法:利用PCR法扩增出抗人p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L,然后分别将嵌合抗体重链基因H和嵌合抗体轻链基因L连接到乳腺特异性表达质粒pBC1,从而构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L。分别将抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异表达载体pBC1-H和pBC1-L线性化,然后使用原核显微共注射法获得8只转基因FVB小鼠,通过鼠尾直接PCR鉴定其转基因阳性。通过RT-PCR、荧光定量PCR鉴定转基因小鼠乳腺组织中抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达。使用小鼠乳汁采集器收集其乳汁并通过Western blot和夹心ELISA等实验鉴定抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26是否获得表达。结果:经测序验证,抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L分别与乳腺特异表达质粒pBC1正确正向连接。鼠尾直接PCR结果显示所获8只转基因FVB小鼠均为转基因双阳性小鼠,且抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L在它们的后代中稳定遗传,它们的后代中转基因小鼠双阳性率约为30%; RT-PCR和荧光定量PCR的结果显示,转基因双阳性小鼠及其双阳性后代的乳腺组织中存在抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达; Western blot和ELISA等实验结果显示,转基因双阳性小鼠乳汁中存在抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的蛋白质表达,而且抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26与羊抗人κ链抗体和羊抗人Ig G Fc-HRP抗体均能特异性结合。结论:成功构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L和制备了抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型,为今后抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因牛乳腺生物反应器的研究奠定了理论和技术基础。     

ht-Pam基因在山羊β-酪蛋白基因座定位整合的研究

利用体细胞基因打靶与核移植技术制备动物乳腺生物反应器是当今转基因定位整合表达的一种新技术。分别克隆山羊的β-酪蛋白基因5′调控区的6.3kb片段,外显子7、外显子8和9三个基因片段,并与克隆的人tPA突变体cDNA一起构建了含有neo和tk正负筛选标记基因的β-酪蛋白基因打靶载体P^GBC4tPA,并验证了neo基因、tk基因以及Cre-LoxP系统的有效性。将线性化的P^GBC4tPA通过电转染整合到山羊胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选,初步获得抗性细胞克隆244个,PCR检测后获得阳性细胞克隆31个,其中初步验证2个细胞克隆转植基因整合位点重组后的基因序列正确,并且该细胞克隆能够有效扩增。这为下一步基因打靶体细胞核移植制备山羊乳腺生物反应器奠定了基础。     

转基因小鼠乳腺表达G-CSF的研究

用PCR法从正常中国人脐带血提取总DNA作为模板,扩增出1.5 kb的人G-CSF基因组基因。序列分析证实其正确性。将其插入小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的起始密码子ATG前的KpnⅠ位点,使其受控于2.6kb的WAP调控序列,构建成乳腺表达载体pWGG。回收经EcoRⅠ酶切后的8.7kb片段用于显微注射。共注射1200枚受精卵,移植34受体母鼠,产仔鼠85只。经PCR检测和DNA印迹分析,证实获得两只整合有人G-CSF基因的雄性鼠,整合率为2.37％。建立的转基因鼠系表明,采用ELASA方法对F1代雌鼠乳汁检测,成功地表达出人G-CSF。表达量为120～250ng/ml。这一结果表明转基因的表达具有乳腺特异性。这为在大动物中实施转基因提供了依据。     

绵羊高效转基因通用型piggyBac转座子载体构建及功能验证

piggyBac (PB)是一种能在多种动物细胞中进行转座的DNA转座子,作为一种转基因工具已被广泛应用于各种哺乳动物转基因研究中。针对不同物种对PB转座子进行改造,是提升其通用性的必要手段。为构建基于绵羊细胞进行转基因操作的通用型PB转座子载体,本研究对PB转座酶(PBase)基因进行绵羊密码子偏好性优化并将其克隆到pBNW-TP1载体中,成功构建了PB转座子载体pBNW-TP2。将pBNW-TP2转染到绵羊成纤维细胞和乳腺上皮细胞中,利用G418筛选获取稳定转染细胞株;利用Tail-PCR检测稳定转染细胞株的PB转座位点,对细胞阳性克隆进行亚甲蓝染色;利用非配对t检验确认其转座效率。结果表明,pBNW-TP2成功介导了绵羊成纤维细胞和乳腺上皮细胞转基因阳性细胞株的生产;PB转座位点检测表明pBNW-TP2能特异性整合到绵羊基因组TTAA位点,其整合位点倾向于功能基因间;亚甲蓝染色统计分析结果提示pBNW-TP2介导的转基因效率显著提升。本研究成功构建了绵羊通用型PB转座子载体pBNW-TP2,并在绵羊体细胞中对其特性进行验证和分析,为PB转座子在绵羊体细胞中开展转基因相关研究提供了科学依据。     

The High-Level Expression of Human Tissue Plasminogen Activator in the Milk of Transgenic Mice with Hybrid Gene Locus Strategy

Transgene expression for the mammary gland bioreactor aimed at producing recombinant proteins requires optimized expression vector construction. Previously we presented a hybrid gene locus strategy, which was originally tested with human lactoferrin (hLF) as target transgene, and an extremely high-level expression of rhLF ever been achieved as to 29.8 g/l in mice milk. Here to demonstrate the broad application of this strategy, another 38.4 kb mWAP-htPA hybrid gene locus was constructed, in which the 3-kb genomic coding sequence in the 24-kb mouse whey acidic protein (mWAP) gene locus was substituted by the 17.4-kb genomic coding sequence of human tissue plasminogen activator (htPA), exactly from the start codon to the end codon. Corresponding five transgenic mice lines were generated and the highest expression level of rhtPA in the milk attained as to 3.3 g/l. Our strategy will provide a universal way for the large-scale production of pharmaceutical proteins in the mammary gland of transgenic animals.     

羊BLG基因5′和3′调控区克隆及其调控GFP基因在乳腺细胞的表达

乳球蛋白 (ＢＬＧ)是反刍家畜的一种主要乳清蛋白质。将外源基因置于ＢＬＧ 5′调控区下游 ,能够控制外源基因在动物乳腺的组织特异性表达。现已清楚在ＢＬＧ 5′端有多个乳核因子 1(ＮＦ1)和转录因子Ｓｔａｔ5的识别位点 ,此外还存在多个激素作用位点[1 ] 。具有这些调控成分的ＢＬＧ 5′翼端 (5′ｆｌａｎｋｉｎｇ)能够控制外源基因在乳腺的表达 ,但受整合位点、外源基因结构以及转基因拷贝数及其排列方式的影响[2 ] 。研究结果表明 ,仅含有 5′调控区的乳腺表达构件 ,还不能使外源基因的表达达到内源性ＢＬＧ的表达水平 ,因为在 5′远端(…     

Construction of a Tc1-like transposon Sleeping Beauty-based gene transfer plasmid vector for generation of stable transgenic mammalian cell clones

We have constructed a single plasmid-, Tc1-like transposon-based gene transfer vector, termed the Prince Charming vector (pPC). The pPC vector was constructed by ligating the CMV-driven "Sleeping Beauty" transposase gene downstream to the Tc1-like transposon inverted repeat (IR) elements and by inserting the RSV promoter (to drive expression of the gene-of-interest) along with a multiple cloning site (MCS), a polyadenylation signal, and the SV40 promoter-driven neomycin gene, at a site flanked by the transposon IR elements. To assess the utility of the pPC vector, we cloned a red fluorescent protein (RFP) gene into the pPC vector at the MCS and transfected human TE85 osteosarcoma cells with the pPC-RFP expression vector using Effectene. Stable transgenic cell clones expressing RFP were selected with G418 sulfate and individual clones were isolated. After 4 weeks of clonal isolation and expansion, 99% of cells in each randomly selected clone expressed RFP strongly. Aliquots of each clone were then maintained in either the presence or the absence of G418 sulfate and were passaged weekly. Even after 6 months in culture in the absence of G418 sulfate, approximately 90% of the cells in each clone still maintained a strong expression level of RFP, indicating that these transgenic cell clones were stable and that the clonal stability of these clones did not require a constant selection pressure. In conclusion, we have developed a single plasmid-, Tc1-like transposon-based gene transfer vector that can be used to generate stable transgenic mammalian cell clones.