小伞山羊草中新型avenin-like基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆小伞山羊草中新型avenin-like（类燕麦储藏蛋白）基因,揭示avenin-like基因的表达模式,并构建avenin-like基因真核胚乳特异性表达载体。方法：利用RT-PCR方法揭示avenin-like基因的表达模式,并用PCR方法从小伞山羊草中克隆新型avenin-like基因;将克隆的avenin-like基因插入表达载体pLRPT构建真核表达载体pLRPT-avel,并经酶切和测序鉴定。结果：avenin-like基因在胚乳中特异性表达;克隆得到新型avenin-like基因,并构建了其真核胚乳特异性表达载体。结论：新型avenin-like基因的克隆及其真核表达载体的构建,为小麦品质改良提供了研究基础。     

鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶基因的克隆及表达载体的构建

为提高鞘蕊苏有效成分的含量,开展Coleus Ent-kaurenoic acid oxidase(KAO)基因的克隆以及表达载体构建方面的研究。提取鞘蕊苏叶片的总RNA,利用套式PCR技术克隆获得KAO基因全长,将该基因连接到克隆载体p MD-18T,经测序鉴定正确后,再将该基因连接到p ET-28a表达载体中。结果显示,成功克隆出的鞘蕊苏KAO基因大小为1 500 bp,对克隆基因进行测序及酶切鉴定,均得到正确大小的DNA片段,说明表达载体构建成功。本研究成功克隆得到鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶基因并构建其表达载体,为提高鞘蕊苏有效成分含量提供了基础。     

兔IFRG基因的克隆及表达分析

实验通过对兔子基因组DNA进行PCR获得兔IFRG基因,将其克隆到pGEM-T载体,双酶切鉴定和测序结果表明成功构建了重组克隆载体pGEM-T-IFRG。通过RT-PCR分析发现IFRG基因在兔不同组织中有不同程度的表达。将重组克隆载体pGEM-T-IFRG和表达载体pET-41（c）经过EcoR1和Xho1双酶切后连接构建重组表达载体pET-41（c）-IFRG,将双酶切鉴定正确的重组表达载体转化入E.coli BL21,IPTG诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE结果显示兔IFRG基因在大肠杆菌中得到了良好的表达。     

人GNAS1基因克隆、真核表达载体的构建及瞬时转染Hela细胞

目的:克隆人GNAS1基因编码区序列、构建真核表达载体并瞬时转染Hela细胞。方法:通过RT-PCR克隆GNAS1基因编码序列,亚克隆至pMD19载体,测序鉴定正确后,通过酶切连接至真核表达载体pEGFP-N1,通过菌液PCR和酶切鉴定获得pEGFP-GNAS1重组质粒;表达载体以Lipofectamine2000介导转染Hela细胞,并用实时定量PCR检测外源基因在Hela细胞中的表达。结果:克隆到GNAS1基因并获得了pEGFP-GNAS1表达载体,在Hela细胞中获得了GNAS1的过量表达。结论:成功克隆了GNAS1基因编码序列,并构建其真核表达载体,瞬时转染至Hela细胞,为进一步深入研究Gsα蛋白生物学作用奠定基础。     

人溶酶体酸性b-葡萄糖脑苷脂酶基因的克隆及其在COS7细胞中的表达

从人胎盘组织提取总RNA, 采用RT-PCR扩增人溶酶体酸性b-葡萄糖脑苷脂酶(Lysosomal acid b-glucosidase, GlcCerase)基因编码区的全部序列, 并克隆到pMD-19T载体上, 构建克隆载体pMD-GlcCerase。经测序验证后, 将GlcCerase亚克隆至表达载体pEGFP-C1上, 构建了人GlcCerase绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-GlcCerase。采用脂质体法将其瞬时转染至COS7细胞系后, 在细胞中检测到了GlcCerase基因, 并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase生物活性的表达。GlcCerase基因的克隆及其表达, 为进一步了解GlcCerase基因的功能以及利用转基因动物乳腺生物反应器高效生产GlcCerase奠定了基础。     

人溶酶体酸性β-葡萄糖脑苷脂酶基因的克隆及其在COS7细胞中的表达

从人胎盘组织提取总RNA,采用RT-PCR扩增人溶酶体酸性β-葡萄糖脑苷脂酶(Lysosomal acid β-glucosidase,GlcCerase)基因编码区的全部序列,并克隆到pMD-19T载体上,构建克隆载体pMD-GlcCerase.经测序验证后.将GlcCerase亚克隆至表达载体pEGFP-C1上,构建了人GlcCerase绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-GlcCerase.采用脂质体法将其瞬时转染至COS7细胞系后,在细胞中检测到了GlcCerase基因,并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase生物活性的表达.GlcCerase基因的克隆及其表达,为进一步了解GlcCerase基因的功能以及利用转基因动物乳腺生物反应器高效生产GlcCerase奠定了基础.     

鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1及其突变体的原核表达

目的:构建鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)及其突变体(NSP1 mu)的原核重组表达质粒,在大肠杆菌中分别融合表达重组NSP1及NSP1 mu。方法:以现有质粒载体为模板,扩增编码NSP1及NSP1 mu的基因片段,并克隆至pMD18-T克隆载体;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析;将阳性克隆的目的片段亚克隆至表达载体pET-28a,并转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并加入IPTG诱导表达,SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达。结果:PCR扩增得到表达NSP1及NSP1 mu的特异片段,并克隆到pMD18-T载体,测序结果正确无误;构建了NSP1和NSP1 mu的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中分别融合表达了重组NSP1及NSP1 mu,表达的目的蛋白均能与His单克隆抗体特异结合;用Ni-NTA琼脂糖试剂盒纯化重组蛋白,获得可溶性的NSP1及NSP1 mu,相对分子质量分别为27×103和28×103。结论:在大肠杆菌中分别表达并纯化获得了大量可溶性重组NSP1及NSP1 mu。     

人脂联素重组克隆载体构建

目的：构建含有人脂联素（adiponectin,ad）基因的重组克隆载体pEGFP-N1-AD,为进一步研究AD与脂质代谢及代谢综合征关系奠定基础。方法：根据Gene-Bank中已经公布的AD设计引物,从含有目的基因的质粒克隆模板中,利用PCR方法钓取目的基因。将AD基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1中。酶切、PCR、及测序鉴定。结果：PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,测序结果与Gene—Bank报道一致。结论：成功构建了AD重组克隆真核表达载体。     

无标记转Fat-1基因真核表达载体的构建及转基因绵羊细胞系的建立

为了建立无筛选标记基因的转Fat-1基因绵羊细胞系,本研究将PCR克隆得到的Fat-1基因,合成的attB、Loxp序列并克隆入pN1-EGFP框架载体,得到可删除筛选标记基因的pEGFP-N1-Fat-1真核表达载体。体外转录合成phiC31整合酶mRNA并与线性化的pEGFP-N1-Fat-1载体共转染绵羊胎儿皮肤成纤维细胞,G418筛选得到表达绿色荧光的单克隆,再利用pET-28a-His-NLS-TAT-Cre质粒诱导Cre重组蛋白表达,将纯化后的Cre穿膜肽转导表达绿色荧光的单克隆细胞,将荧光淬灭的细胞系扩繁,提取基因组DNA,进行PCR及测序鉴定,得到无标记转Fat-1基因绵羊胎儿皮肤成纤维细胞系,为生产无筛选标记基因的转基因绵羊奠定基础。     

小鼠IL-39的克隆及真核表达载体的构建北大核心

[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。     

靶向性DNA甲基化酶在pET32a原核表达载体中的表达和鉴定

目的:在pET32a原核表达载体中表达融合myc-6his标签的靶向性甲基化酶B1-3a并进行鉴定。方法:以含有B1-3a基因的pcDNA4.0-B1-3a-myc-6his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc-6his标签序列的目的区段B1-3a,然后克隆入表达载体pET32a;以SDS-PAGE和Western blot方法对表达产物进行鉴定。结果:表达产物中在分子量43kD左右可见与目的蛋白分子量相符的条带,该条带可被6his标签单克隆抗体特异识别。结论:正确构建了靶向性甲基化酶B1-3a的原核表达载体,靶向性甲基化酶能够在pET32a中成功表达。     

人LRG1基因的原核表达及生物信息学分析

为了探讨LRG1基因结构与功能,对该基因进行克隆并构建到原核表达载体上,并对其进行表达及生物信息学分析。用Trizol法提取人肝癌HepG2细胞总RNA后,PCR扩增得到LRG1片段,经鉴定后将目的基因与原核表达载体pET28a连接,经诱导表达获得His-LRG1蛋白。LRG1基因cDNA片段大小为1 044 bp,编码347个氨基酸;成功构建pET28a原核表达载体,经多次不同条件诱导后,得到大小约40 kD目的蛋白;利用软件对LRG1蛋白的一级、二级结构进行了预测,分析总结得LRG1基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,可与多种信号开关相互作用。LRG1属于高度保守的富亮氨酸重复家族成员,其原核表达载体不易诱导产生大量目的蛋白,克隆表达该基因有利于验证其结构与功能关系。     

甲基丙二酰辅酶A 变位酶表达载体的构建及初步表达

目的:克隆表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM)蛋白,为进一步研究相关基因突变对功能的影响机制奠定基础。方法:自人外周血淋巴细胞中提取总RNA、逆转录,并与pET32a构建融合蛋白原核表达载体;优化蛋白表达诱导条件;经SDS-PAGE、WesternBlot检测目的蛋白的表达。结果:经酶切鉴定并经测序证实获得全长2210bp的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因(MUT),并成功构建融合蛋白原核表达载体,SDS-PAGE在102 kDa处获得目的条带,Western Blot检测确定为MCM表达蛋白。结论:成功克隆表达出MCM表达蛋白。     

辛德毕斯病毒E2包膜蛋白可溶性表达条件的优化

目的:通过优化表达条件,提高辛德毕斯病毒E2包膜蛋白胞外区的可溶性表达量。方法:构建含E2基因胞外区的重组表达质粒pGEX-6p-1-E2,筛选合适宿主菌和诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、 pGro7、pKJE7、 pG-Tf2和pTf16 5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pGEX-6p-1-E2共表达),筛选最适分子伴侣质粒。结果:(1)E2蛋白的表达量在E.coli BL21、BL21 (DE3) pLysS、Rosetta (DE3)及Origami B (DE3) 4种表达菌中没有明显差别;(2)16℃诱导时E2蛋白在上清中可溶性表达量最高;(3)分子伴侣质粒pG-Tf2使目的蛋白的可溶性表达量提高了15.7%,作用最为显著。结论:通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了E2蛋白的可溶性表达,为进一步E2蛋白的相关研究奠定了基础。     

抗AIDS新型导向毒素CVN-LP1融合基因的构建及原核表达

目的：构建重组抗病毒融合蛋白CVN-LP1原核表达载体,并进行表达和鉴定。 方法：将本室已经构建好的pET-CVN和pET-LP1,用EcoRⅠ和HindⅢ同时进行双酶切,将所得的CVN片段连入pET-LP1载体上,构建pET-CVN-LP1表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。用SDS-PAGE,Western-blot等方法分析鉴定表达产物。 结果：重组载体pET-CVN-LP1经PCR和双酶切鉴定,证实构建成功。将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物相对分子量为20KD左右,与理论预期值完全相符。凝胶成像分析表明最高表达量可占菌体总蛋白的16.86%。SDS-PAGE、Western-blot分析表明目的蛋白得到了很好的表达。 结论：构建了pET-CVN-LP1原核表达载体,并成功地获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。     

巴尔通体（Bartonella tribocorum）P26蛋白原核重组表达研究

目的 构建巴尔通体表面蛋白p26基因的原核重组表达载体,表达和纯化重组表达蛋白P26,并鉴定其抗原性.方法 利用PCR方法从巴尔通体B.tribocorum厦门分离株的基因组DNA中扩增出p26蛋白基因,并将该基因的编码区克隆到pGEX-4T-1表达载体中,从而构建GST-p26融合蛋白原核重组表达载体.将表达载体转化大肠埃希菌（E.coli DH5α）,诱导表达GST-p26,并运用亲和层析技术纯化蛋白.通过蛋白质斑点印迹试验和间接ELISA法检验GST-p26是否具有抗原性.结果 成功构建了p26的原核表达载体,该表达载体可在E.coli DH5α中大量表达GST-p26,原核表达的GST-p26能够与感染动物血液样本发生特异性免疫反应.结论 原核重组表达的GST-p26可作为潜在的抗原,应用于巴尔通体的血清学检测.     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

人源蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2基因克隆与原核表达

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:以人脑组织mRNA为模板,通过RT-PCR扩增出目标cDNA,构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2-pEASY-E1重组质粒。将重组质粒转化进E.coli TOP10感受态细胞中,通过菌落PCR和测序进行阳性克隆的筛选和验证,将正确的质粒转化E.coli Transetta感受态细胞中,通过SDS-PAGE和western-blot进行蛋白检测和验证,酶促动力学分析SHP-2可溶性蛋白的活性。结果:成功克隆SHP-2功能域,构建SHP-2-pEASY-E1原核表达载体,完成可溶性蛋白的表达;酶促动力学分析结果为:米氏常数Km=0.97mmol/L,Vmax为13.57mmol/L/s。结论:本研究成功构建SHP-2的原核表达载体,重组表达的SHP-2蛋白具有较高的磷酸酶活性。     

基于GST-pull down的小G蛋白Rac1活性检测体系的建立

目的:根据人PAK1基因的p21结合结构域(PBD)能够特异结合GTP-Rac1的特性,构建GST-PBD原核表达质粒,并利用GST-pull down方法检测真核细胞内小G蛋白Rac1的活性。方法:将人PAK1基因的PBD结构域克隆到pGEX原核表达载体上,经诱导纯化得到GST-PBD融合蛋白,并通过GST-pull down实验评估该方法的特异性和准确性。结果:pGEX-PBD质粒构建成功;纯化得到的GST-PBD融合蛋白能够特异性地与激活形式的Rac1(GTP-Rac1)结合,并且能够准确反映血小板衍生生长因子刺激下细胞内Rac1的激活过程。结论:GST-PBD融合蛋白及其整套GST-pull down检测体系能方便有效地检测细胞内Rac1的活性。