分子伴侣及信号肽对毕赤酵母中分泌蛋白表达水平的影响

目的：探索定位于细胞质、内质网膜及内质网腔中的分子伴侣及其组合对于带有不同信号肽的胞外β-1,3-葡聚糖酶（EXGl）在巴斯德毕赤酵母GS200中表达水平的影响。方法：通过融合PCR技术分别构建带有酵母a交配因子引导肽序列（仅MF）、酵母仅交配因子信号肽序列（ccPre）和重链结合蛋白（Bip）信号肽序列的报告蛋白EXGl的表达质粒pPIC9-EXG1,同时构建分子伴侣基因及其组合的表达质粒pBLArg-IV,然后将2种重组质粒共转化至毕赤酵母宿主菌GS200,转化子经筛选获得共表达菌株,通过测定EXG1酶活来评价分子伴侣与信号肽对其表达水平的影响。结果：细胞质及内质网膜上的分子伴侣Sec61a、Sec61B及胞质中的分子伴侣Ydjl、Ssal、Hsp104及其组合对各种信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平没有显著影响。然而,内质网腔中的分子伴侣Bip、EroI、PDI与HacI组合能显著提高报告蛋白EXG1的表达水平,其中,以aMF或ctPre作为信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平分别提高了2．6倍和3．8倍,以Bip信号肽引导的报告蛋白EXGl的表达水平提高了20％～45％,而对于以EXG1自身信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平没有显著影响。结论：在酵母表达体系中,内质网腔中的分子伴侣是报告蛋白EXG1表达水平的重要影响因素．但分子伴侣对于信号肽的选择性还须进一步证明。     

绿色木霉LTR-2 β-1, 3-葡聚糖酶基因的克隆及其在 毕赤酵母中的表达

根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以高产β-1,3-葡聚糖酶菌株--绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到内切β-1,3-葡聚糖酶基因(glu).将glu克隆至载体pMD18-T上,进行了全序列测定.序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成,含有一个开放阅读框架,可以编码762个氨基酸,与报道基本相同.翻译后的氨基酸序列含有两个β-1,3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF.基因与已发表的木霉β-1,3-葡聚糖酶基因有较高的同源性,其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%.序列已经提交GenBank,登录号为EF176582.将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中,获得重组质粒pGLU14,经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71.经大量平板筛选,获得能有效分泌表达β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14,菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中.SDS电泳结果表明其β-1,3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa,和理论推测值大致相同.摇瓶发酵结果表明,培养基中β-1,3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL.     

里氏木霉内切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用外显子拼接的方法,以里氏木霉Trichoderma reesei基因组 DNA 为模板,克隆出内切-1,4-β-D-葡聚糖酶II基因egl2的全编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pQY2025。重组质粒线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达内切葡聚糖酶II的毕赤酵母工程菌株Gp2025。用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,培养基中内切葡聚糖酶II的活力可达1573.0U/mL,同时对重组内切葡聚糖酶II的性质进行了初步研究。     

白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达

为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用,通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白,采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B.rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的c DNA序列;并对该序列进行生物信息学分析;进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框,编码343个氨基酸,相对分子量为38.102k Da,理论等电点为6.63,其与菜心(B.rapa subsp.chinensis)和甘蓝型油菜(B.napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,含有1个信号肽,存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示,4°C时该基因上调表达,继续低温(–4°C)胁迫处理,该基因上调表达至峰值,至–8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因（BGL1）,长度为2596 bp,连接到pGEM-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框,构建成重组质粒pSHL9K.通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株.重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4.培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL.     

解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达

目的:克隆解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA)使其在解淀粉芽孢杆菌CICIM B4081中高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)染色体DNA为模板,经过PCR扩增得到了大小约为0.8kb的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA),构建了重组表达质粒pQ-bglA,通过电转化的方法将其转化人解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)中.结果:得到了能高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌.在250mL摇瓶条件下,重组菌分解地衣多糖的胞外最高酶活达到了1515.7U/mL,重组酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH值为6.5.结论:重组菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活为原始菌株的11.84倍,实现了bglA基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达.     

β-1,3-葡聚糖酶在植物抗真菌病基因工程中的研究进展

β-1,3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物质之一,植物β-1,3-葡聚糖酶可由病原物(如Mg)、化学因子(如水杨酸、乙烯、赤霉素)或物理因子(如紫外线照射、机械损伤)等多种生物因子和非生物因子诱导产生.将外源β-1,3-葡聚糖酶基因导入植物,可提高植物的抗真菌病害的能力;而将β-1,3-葡聚糖酶基因与其他防卫蛋白基因同时导入植物,将更大程度的提高植物的抗真菌病能力,是植物抗真菌病防治的有效新途径.文章中主要对β-1,3-葡聚糖酶的生物学特性、植物β-1,3-葡聚糖酶基因在转基因植株中的独立表达及其与其他抗真菌病基因的协同表达等进行了综述.     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在工业啤酒酵母中的整合和表达

用PCR合成的瑞氏木霉（T.reesei）β-内切葡聚糖酶Ⅰ（EGⅠ）的cDNA, 构建了由酵母醇脱氢酶 （ADH1）启动子和终止子引导表达、β-内切葡聚糖酶自身信号肽序列引导分泌、由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIP型β-内切葡聚糖酶表达分泌质粒pA15PET。采用pA15PET与酵母YEP型G418抗性表达质粒的共转化,将EGⅠ表达单元整合到已整合有α-乙酰乳酸脱羧酶（α-ALDC）表达单元的啤酒酵母工程菌BE9711的染色体rDNA序列中,获得同时表达胞内α-ALDC和胞外β-内切葡聚糖酶的啤酒酵母工程菌。     

三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因克隆及其低温下SA处理后的表达分析

以三明野生蕉(Musaspp.AB group)为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆获得β-1,3葡聚糖酶5个基因(Mugsp1.2~Mugsp5)的cDNA和DNA序列。序列和生物信息学分析表明Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5的ORF长度分别为1 020、1 047、999、1 023和960bp,分别编码339、348、332、340和319个氨基酸;Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4蛋白具有N端和C端(CTPP)信号肽结构,推测为Ⅰ类β-1,3葡聚糖酶,而Mugsp3只含有N端信号肽,无CTPP结构,Mugsp5则不具有信号肽结构;构建Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4瞬时表达载体并转化洋葱表皮的亚细胞定位观察结果显示,常温下Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4主要在细胞膜、细胞质上表达,而经过8℃低温处理后Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4均能够转移至细胞核表达;β-1,3葡聚糖酶基因在不同低温处理下的实时荧光定量(qRT-PCR)检测结果显示,β-1,3葡聚糖酶基因均能响应低温胁迫,是低温胁迫相关基因,但基因间表达水平存在差异;低温下SA处理后的定量结果显示,SA处理会推迟β-1,3葡聚糖酶基因的表达。     

超耐热酸性α-淀粉酶基因在多型汉逊酵母中表达及与在毕赤酵母中表达的比较研究

利用毕赤酵母的质粒载体pPIC9K将极端耐热古菌Pyrococcusfuriosus的超耐热酸性α-淀粉酶(Amy)基因转化到多型汉逊酵母HP-6中,获得重组汉逊酵母。经过甲醇进行诱导,表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳,证明α-淀粉酶(Amy)在多型汉逊酵母中利用AOX1启动子和α-因子信号肽有效表达并分泌到胞外。该酶的最适反应温度为90～100℃,最适作用pH为4.0～5.0,较之重组毕赤酵母的最适作用pH还低0.5。此外与毕赤酵母的重组蛋白相比,重组汉逊酵母α-淀粉酶不仅菌株筛选简便、周期短,而且具有更容易筛选到高拷贝转化子以及适用于大规模工业发酵等优点。     

甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析

以高粱β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase gene)cDNA序列为探针,搜索甘蔗EST数据库,而后通过电子克隆技术,拼接获得甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因ScBG。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、卷曲螺旋、亚细胞定位、信号肽、功能域及高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:ScBG基因全长1270bp,包含一个长达1011bp的完整开放读码框(open reading frame,ORF),编码336个氨基酸,分子量为34.8KD,理论等电点为4.98。该蛋白质很可能是胞外定位的诱导物释放型酸性葡聚糖酶,是一种稳定的分泌蛋白,且可信度达最高等级1。该蛋白属于糖苷水解酶第17家族,含有N端信号肽,在第7～29位氨基酸处含有跨膜信号区,在第31～321位氨基酸处含有糖苷水解酶17家族结构域,含2个主要的功能结构域。10个物种ScBG蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,甘蔗ScBG基因编码蛋白与高粱β-1,3-葡聚糖酶基因的编码蛋白的同源性最高,达79.82%。以上研究结果为ScBG基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用提供基础。     

毕赤酵母基因工程菌胞内AOX酶的检测方法

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为外源基因的表达宿主,已成功表达出一系列胞内和胞外蛋白[1～6],并已建立起了一套较成熟的发酵工艺.巴斯德毕赤酵母基因工程菌的外源基因,由胞内AOX酶(乙醇氧化酶)基因启动子调控.在非甲醇碳源条件下(如甘油或葡萄糖),AOX酶基因表达被抑制,外源基因也处于不表达状态.而以甲醇为唯一碳源时,AOX酶在胞内大量合成,同时外源基因被调控表达.在一般情况下,AOX酶的变化直接反映了外源基因的表达状况,因此通过分析检测胞内AOX酶的含量和变化速率,就可以确定外源基因所处的状态.     

降低诱导温度提高毕赤酵母甲醇代谢关键酶基因转录水平和猪-α干扰素生产性能

以一株表达猪-α干扰素(pIFN-α)重组毕赤酵母为研究对象,考察了诱导温度对pIFN-α表达、细胞代谢活性及甲醇代谢关键酶的影响.在5 L发酵罐开展毕赤酵母高密度流加培养生产表达pIFN-α研究,利用实时PCR技术对不同诱导温度、诱导稳定期的胞内甲醇代谢关键酶(包括解毒酶)基因转录水平进行定量分析.低温(20℃)可以...     

合成耐高温α-淀粉酶PFA在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

PFA是来源于Pyrococcus furious的一种耐高温α-淀粉酶,为了使PFA能够在巴斯德毕赤酵母中高效表达,根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性对PFA的基因序列进行密码子优化,人工合成耐高温淀粉酶PFA基因pfa,并连接到巴斯德毕赤酵母中表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-pfa。重组质粒线性化后转化到巴斯德毕赤酵母菌株GS115中,重组菌株在摇瓶中用甲醇诱导表达,分泌表达酶活最高为220U／L。     

大豆β-1,3-葡聚糖酶(GmBG1)及其同源蛋白的生物信息学分析

β-1,3-葡聚糖酶是普遍存在于多种生物中的一类多基因家族蛋白,属于PR-2家族蛋白,与植物的生长发育及防御体系有关。克隆和鉴定大豆β-1,3-葡聚糖酶家族基因对大豆抗逆育种具有重要意义。本研究应用生物信息学的方法共筛选获得45个β-1,3-葡聚糖酶基因。结果表明,GmBG1具有典型的β-1,3-葡聚糖酶家族的保守结构域及氨基酸位点,含有347个氨基酸,pI值为8.71,二级结构以ɑ螺旋为主,且N端信号肽为α螺旋结构,属于碱性蛋白。大豆β-1,3-葡聚糖酶家族基因主要在根和花中表达;实时荧光定量PCR分析表明,在腐霉菌P.ultimum的侵染下GmBG1基因在不同的抗病品种中的表达量存在差异;GmBG1基因在抗病品种中24 h时表达水平最高,而感病品种的该表达量无明显变化;此外抗病品种的该表达量明显高于感病品种。     

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达

对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温α-淀粉酶(amyE)基因进行改造获得的基因突变体(amyEM),通过PCR扩增,将此基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pBV220和毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并分别转化大肠杆菌DH5α和毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组大肠杆菌和重组毕赤酵母。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE分析,证明突变α-淀粉酶(AmyEM)在大肠杆菌、毕赤酵母中获得有效表达。对重组大肠杆菌产生的α-淀粉酶的粗酶性质分析表明,此酶分子量约为55kDa。其最适反应温度为80℃~90℃,与野生型基因相比,其最适pH均为6.0,但不同的是突变体在pH 5.0~5.5时表现出较高的酶活力;在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。由于酵母可对蛋白进行糖基化,酶分子量增加到60kDa,最适pH也改变为5.5。此高温α-淀粉酶突变体所具有的在微酸性环境具有较高酶活力的性质,具有重要的潜在工业应用价值。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

藤黄节杆菌β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

以藤黄节杆菌基因组为模板,克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因,分别构建至原核表达载体pET-28a(+)与pBAD18上,诱导获得高效表达,粗酶液对酵母多糖的裂解活性达到161 U/mL。在裂解酵母试验中,粗酶液也表现出较高的活性。研究中得到一株突变株,其对于研究β-1,3-葡聚糖酶在裂解酵母中多糖结合域的地位和作用有着重要的价值。     

不同分泌信号对豹蛙酶在巴斯德毕赤酵母中分泌效率的影响

目的：研究不同分泌信号对豹蛙酶（ONC）在巴斯德毕赤酵母中分泌效率的影响。方法：根据已知天然ONC的氨基酸序列,结合酵母偏爱密码子,设计并合成了ONC基因序列,通过融合PCR获得了不同分泌信号与ONC的融合基因,将其克隆至表达载体pPIC9k中,然后将线性化的重组表达载体电击转化GS115毕赤酵母感受态细胞,通过SDS-PAGE检测目的蛋白表达量。结果：糖基化ONC表观相对分子质量为（14～16）×103,且其糖基化不均匀,非糖基化蛋白肽链的相对分子质量约为12×103;采用不含EAEA结构的α交配因子作为分泌信号时ONC没有表达,利用含EAEA结构的α交配因子和α交配因子的pre肽作为分泌信号时均能够显著提高其表达量。结论：采用含EAEA结构的α交配因子和α交配因子的pre肽作为分泌信号均能够显著提高ONC在巴斯德毕赤酵母中的表达量。     

单纯疱疹病毒2型糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体的构建及序列分析

构建单纯疱疹病毒2型包膜糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体,并对序列进行分析,为进行高抗原性的真核表达重组gD蛋白奠定基础。采用PCR扩增HSV2-gD成熟肽基因,将该段基因克隆于pGEM-T克隆载体,转化鉴定后,与巴斯德毕赤酵母表达载体(pPIC9K)酶切连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选测序确定构建了pPIC9K?gD的真核表达载体,对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性及抗原性。结果显示,获得的重组的酵母表达载体pPIC9K-gD,测序结果证实为HSV2-gD成熟肽基因,序列分析其高度保守,预测蛋白分子量40.63kD,等电点pI为7.15,包含完整成熟肽分值达1.7的多个抗原决定簇。成功构建了HSV2-gD成熟肽基因的毕赤酵母表达载体。