蛋白质内含子在特定氨基酸序列中的剪接

基因工程技术已经被广泛应用于抗体的生产。但是由于抗体的分子量较大,导致合成抗体较为困难。蛋白质内含子是前体蛋白质中的一段氨基酸序列,能够将自身剪切出来,并将两端的外显子连接形成成熟的蛋白质。将抗体的Fab(antigen binding fragment)和Fc(crystalline fragment)分别与蛋白质内含子(intein) 的N端(IN)和C端(IC)融合表达,利用蛋白质内含子的剪接功能,可形成完整的抗体分子。KSCDKTH是存在于抗体铰链区(hinge region)的一段氨基酸序列,如果在KSCDKTH序列中筛选到高效剪接的蛋白质内含子,即可通过蛋白质剪接,将抗体分子的Fab和Fc剪接形成完整抗体。本文筛选发现,Ssp DnaX的3种断裂蛋白质内含子(S0, S1, S11)具有在KSCDKTH序列中高效剪接的能力,这一研究结果为抗体的剪接合成提供了可行性。     

高剪接活性断裂蛋白质内含子的体内切割

蛋白质内含子介导的断裂(切割)反应被用于蛋白质纯化、连接和环化等,但目前仍存在断裂效率低、断裂反应的不可控、产物复杂等问题。蛋白质内含子的定点突变可导致其N端或C端断裂。其末位氨基酸突变则剪接反应第3步天冬酰胺环化无法进行,发生N端断裂;其首位氨基酸发生突变则剪接反应第一步酰基重排及其后续步骤均无法进行,而天冬酰胺环化仍可进行,发生C端断裂。利用已获得的高剪接活性的S1和S11型断裂蛋白质内含子Ssp GyrB,分别将其参与剪接反应的首位半胱氨酸或末位天冬酰胺突变为丙氨酸,构建能够发生一端断裂的断裂蛋白质内含子。研究结果表明,突变后断裂蛋白质内含子的剪接反应几乎不发生,其断裂活性有不同程度的提高,获得了在大肠杆菌体内具有较高效断裂活性的断裂蛋白质内含子。这将为进一步研究其体外可控性剪接、构建高效的蛋白纯化系统和深入研究蛋白质内含子的剪接机制提供基础。     

双Intein介导3片段vWF的反式剪接

von Willebrand因子(vWF)基因突变导致血管性血友病(VWD),由于其基因过大在基因治疗研究中难以为多数病毒载体携带.利用双内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能研究断裂成3段的vWF基因分别表达后在蛋白水平的连接,旨在为vWF基因的3载体联合转移应用于VWD基因治疗研究提供依据.将vWF cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段(N、M和C),分别与splitSspDnaE intein的N端(En)、C端(Ec)和splitSspDnaB intein的N端(Bn)、C端(Bc)编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)中的His-Tag的下游,得到3种表达载体pET-NEn、pET-EcMBn和pET-BcC.分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE分析融合蛋白的表达,并进一步用His-Tag的特异性抗体进行分析;亲和层析纯化分别表达的带His-Tag标签的3段蛋白,复性后体外混合进行剪接实验以观察3片段vWF的连接.结果显示,3段预期大小的融合intein的vWF蛋白均有表达,用His-Tag抗体进行的Western印迹得到进一步证实;3段纯化的蛋白混合后可见明显的剪接条带形成,与vWF的预期分子量大小一致,表明双intein通过蛋白质反式剪接可有效连接3个片段的vWF,为进一步应用蛋白质剪接技术的3重载体真核细胞转vWF基因奠定了基础.     

利用ELP-Intein系统在大肠杆菌中生产抗菌肽DLP4

DLP4 （defensin-like peptide 4）是一种新型昆虫防御素抗菌肽,对革兰氏阳性细菌具有强大的抗菌活性而且不易产生抗药性。本研究利用类弹性蛋白（elastin-like polypeptide, ELP）的相变特性和蛋白质内含子（intein, I）的C端断裂系统,通过构建重组表达质粒pET-ELP-I-DLP4,以大肠杆菌（Escherichia coli）作为宿主细胞,诱导表达后的重组蛋白通过简单的离心、pH和温度转变进行纯化得到DLP4。研究中发现,在表达纯化过程中蛋白质内含子发生了C端提前断裂。为了解决这一问题,将其断裂为N端片段（I0_N）和C端片段（I0_C）后,分别与ELP或DLP4融合,构建了pET-ELP-I0_N和pET-ELP-I0_C-DLP4两种重组表达质粒。分别在大肠杆菌中诱导表达,将表达后的菌液混合,使蛋白质内含子恢复C端断裂活性,最终得到的DLP4的得率约为1.49 mg/L。抑菌试验证明纯化的DLP4表现出预期活性,这为DLP4在原核系统中的表达纯化提供...     

异源生物中筛选高剪接活性Intein系统的建立

原始物种体内蛋白质内含子（intein）介导的自催化蛋白剪接反应以100%效率进行.当这些蛋白质内含子被克隆入异源物种时,其剪接效率往往大大降低,绝大多数甚至完全失去剪接能力.本研究根据蛋白质内含子剪接活性与蛋白质外显子（extein）C端第1个保守氨基酸直接相关的特点,设计含有所有这些保守氨基酸的多个短的蛋白质外显子序列,通过PCR引入到卡那霉素抗性蛋白（KanR）的不同位点中,在此外显子中克隆入相应的蛋白质内含子,构建在大肠杆菌中依赖卡那霉素抗性来筛选高剪接活性蛋白质内含子的系统.结果显示,卡那霉素平板上菌落生长的结果与Western印迹检测的结果基本一致.说明建立的筛选高剪接活性蛋白质内含子系统成功.这种含有可选择蛋白质外显子的筛选系统,将蛋白质剪接与卡那霉素抗性相结合,直接从平板上观测剪接结果,成为快速、稳定筛选在异源物种中具有剪接活性蛋白内含子的新手段.     

定向进化提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3 剪接活性的研究

目前,蛋白质内含子在蛋白质工程领域中得到越来越广泛的应用。为提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3(Trichodesmium erythraeum)在异源宿主中的剪接活性,采用易错PCR技术,通过改变反应体系中dNTP、Mg2+、Mn2+的浓度等手段,借助依赖卡那霉素的蛋白质内含子筛选系统进行筛选。Western印迹结果表明:通过定向进化,其中5号突变体的剪接活性从原始的约20%提高至约85%;9号突变体能够避免发生剪接副反应,即N端断裂反应。氨基酸突变位点与剪接活性变化的相关性分析表明:参与α-helix形成的氨基酸的突变极有可能影响蛋白质内含子的断裂反应,参与β-sheet形成的氨基酸的突变则有可能影响蛋白质内含子结构的紧凑性。通过定向进化提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3在异源宿主中的剪接活性,进一步验证依赖卡那霉素抗性的筛选系统的可行性,为扩大蛋白质内含子的应用范围奠定基础。     

DNA展示系统介导的断裂蛋白质内含子体外定向进化方法的研究

蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中,生物素化基因在人工细胞中与其表达的融合蛋白（内含子C端-外显子-生物素结合蛋白）形成DNA 蛋白质连接体。只有能与后续加入的N端蛋白质内含子前体（Flag-内含子N端）发生剪接反应的DNA 蛋白质连接体,才能被加上旗帜标签（Flag）,从而被抗旗帜标签抗体纯化柱（Anti Flag antibody M2 agarose）筛选富集。为了验证该系统的可行性,实验构建了2个基因,即含有具剪接活性的蛋白质内含子的阳性基因IRC和含有不具剪接活性的蛋白质内含子的阴性基因IRCM。实验首先通过Western印迹和琼脂糖凝胶电泳证明,人工细胞中的体外转录翻译系统不仅可高表达500个氨基酸的蛋白质,而且表达的蛋白中内含子仍保持原有的剪接能力。生物素结合蛋白能结合95%的DNA,并且形成的DNA 蛋白质连接体可以被筛选富集,最终证明了该系统用于断裂蛋白质内含子定向进化筛选的可行性。随后,为了检测系统的富集效率,制备了人为的基因“突变库”,即将基因IRC和IRCM以摩尔比1:10的比例混合,经过2轮筛选后,阳性基因IRC可以被10倍富集,进一步证明了体外筛选方法的可行性。该方法为后续针对不同宿主进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选方法支持,也为断裂蛋白质内含子的在生物技术和研究领域的应用奠定了基础。     

PRP8蛋白质反式剪接系统的建立

真菌病原体Cryptococcus neoformansAD血清型剪接体蛋白PRP8蛋白质内含子是目前 发现的第2个存在于真核生物体核基因组中的蛋白质内含子.它的宿主基因prp8编码的PRP 8蛋白作为剪接体的1个组分,是1个高度保守的mRNA剪接蛋白.将组氨酸标签插入克隆自真菌病原体Cryptococcus neoformans AD血清型的PRP8蛋白质内含子中,并将该蛋白质内含子进行人工断裂,获得断裂蛋白质内含子,在大肠杆菌中鉴定其剪接活性.研究结果表明：所获得的改造型蛋白质内含子均表现出高效的剪接活性.利用此Cryptococcus neoformansAD血清型PRP8 断裂蛋白质内含子,成功构建了蛋白质反式剪接系统.这一反式剪接系统可用于其他蛋白质的连接与合成,有望成为蛋白质工程中的一种有用工具.     

蛋白质内含子的研究进展

自1990年发现第一个蛋白质内含子以来,对其研究愈加引起注意。蛋白质内含子是蛋白质剪接元件,可从前体蛋白中切除并将两侧外显子连接起来成为成熟蛋白质,标准的蛋白质剪接主要包括四步亲核置换反应,新近又发现一种反式剪接机制。蛋白质内含子的演化形成存在先天遗传和后天插入两种方式,但目前还没有直接的实验证据。数据库显示,蛋白质内含子有10个保守模体：A、N2、B、N4、C、D、E、H、F和G,它们在蛋白质剪接过程中具有不同的作用。作为蛋白质剪切元件的蛋白质内含子,是蛋白质工程中一个功能强大的工具,具有重要的实践意义。现对蛋白质内含子的命名、分布、结构、剪接方式以及应用前景等作一全面的综述。     

内含肽介导的氯离子通道蛋白CFTR的反式剪接

研究利用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能在大肠杆菌中对囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR)的反式剪接作用.CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病囊性纤维化(cystic fibrosis, CF).将CFTR的cDNA于剪接反应所需的保守性氨基酸残基Ser-660前断裂为N端和C端,分别与split mini Ssp DnaB 内含肽的106个氨基酸残基的N端和48个氨基酸残基的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pBV220 诱导表达后SDS-PAGE可见预期大小剪接形成的CFTR蛋白条带,Western印迹用CFTR特异性抗体进一步证明为剪接所产生的CFTR蛋白,表明内含肽可有效催化CFTR的反式剪接.     

The Deinococcus radiodurans Snf2 intein caught in the act: Detection of the Class 3 intein signature Block F branched intermediate

Inteins are the protein equivalent of introns. They are remarkable and robust single turnover enzymes that splice out of precursor proteins during post‐translational maturation of the host protein (extein). The Deinococcus radiodurans Snf2 intein is the second member of the recently discovered Class 3 subfamily of inteins to be characterized. Class 3 inteins have a unique sequence signature: (a) they start with residues other than the standard Class 1 Cys, Ser or Thr, (b) have a noncontiguous, centrally located Trp/Cys/Thr triplet, and (c) all but one have Ser or Thr at the start of the C‐extein instead of the more common Cys. We previously proposed that Class 3 inteins splice by a variation in the standard intein‐mediated protein splicing mechanism that includes a novel initiating step leading to the formation of a previously unrecognized branched intermediate. In this mechanism defined with the Class 3 prototypic Mycobacteriophage Bethlehem DnaB intein, the triplet Cys attacks the peptide bond at the N‐terminal splice junction to form the class specific branched intermediate after which the N‐extein is transferred to the side chain of the Ser, Thr, or Cys at the C‐terminal splice junction to form the standard intein branched intermediate. Analysis of the Deinococcus radiodurans Snf2 intein confirms this splicing mechanism. Moreover, the Class 3 specific Block F branched intermediate was isolated, providing the first direct proof of its existence.     

Improved protein splicing using embedded split inteins

Naturally split inteins mediate a traceless protein ligation process known as protein trans‐splicing (PTS). Although frequently used in protein engineering applications, the efficiency of PTS can be reduced by the tendency of some split intein fusion constructs to aggregate; a consequence of the fragmented nature of the split intein itself or the polypeptide to which it is fused (the extein). Here, we report a strategy to help address this liability. This involves embedding the split intein within a protein sequence designed to stabilize either the intein fragment itself or the appended extein. We expect this approach to increase the scope of PTS‐based protein engineering efforts.     

蛋白内含子与蛋白剪接

蛋白内含子和蛋白剪接是蛋白质研究的前沿领域。重点介绍了蛋白内含子的结构和蛋白剪接机理的最新研究成果 ;蛋白内含子如同RNA剪接中的内含子 ,也是一类可移动的遗传元件 ;蛋白内含子目前研究的热点是蛋白内含子的功能研究及其在蛋白质工程和其它生物工程领域的用。     

A conserved threonine spring‐loads precursor for intein splicing

Protein splicing is an autocatalytic process where an “intein” self‐cleaves from a precursor and ligates the flanking N‐ and C‐“extein” polypeptides. Inteins occur in all domains of life and have myriad uses in biotechnology. Although the reaction steps of protein splicing are known, mechanistic details remain incomplete, particularly the initial peptide rearrangement at the N‐terminal extein/intein junction. Recently, we proposed that this transformation, an N‐S acyl shift, is accelerated by a localized conformational strain, between the intein's catalytic cysteine (Cys1) and the neighboring glycine (Gly‐1) in the N‐extein. That proposal was based on the crystal structure of a catalytically competent trapped precursor. Here, we define the structural origins and mechanistic relevance of the conformational strain using a combination of quantum mechanical simulations, mutational analysis, and X‐ray crystallography. Our results implicate a conserved, but largely unstudied, threonine residue of the Ssp DnaE intein (Thr69) as the mediator of conformational strain through hydrogen bonding. Further, the strain imposed by this residue is shown to position the splice junction in a manner that enhances the rate of the N‐S acyl shift substantially. Taken together, our results not only provide fundamental understanding of the control of the first step of protein splicing but also have important implications in various biotechnological applications that require precursor manipulation.     

蛋白质剪切及其应用

蛋白质剪切是一种翻译后修饰事件 ,它将插入前体蛋白的中间的蛋白质肽段 (Intein ,internalproteinfrag ment)剪切出来 ,并用正常肽键将两侧蛋白质多肽链 (Extein ,flankingproteinfragments)连接起来。在此过程中不需要辅酶或辅助因子的作用 ,仅需四步分子内反应。Intein及其侧翼序列可以通过突变产生高度特异性的自我切割用于蛋白质纯化、蛋白质连接和蛋白质环化反应 ,在蛋白质工程方面有广泛的应用前景。     

NMR and crystal structures of the Pyrococcus horikoshii RadA intein guide a strategy for engineering a highly efficient and promiscuous intein

In protein splicing, an intervening protein sequence (intein) in the host protein excises itself out and ligates two split host protein sequences (exteins) to produce a mature host protein. Inteins require the involvement for the splicing of the first residue of the extein that follows the intein (which is Cys, Ser, or Thr). Other extein residues near the splicing junctions could modulate splicing efficiency even when they are not directly involved in catalysis. Mutual interdependence between this molecular parasite (intein) and its host protein (exteins) is not beneficial for intein spread but could be advantageous for intein survival during evolution. Elucidating extein-intein dependency has increasingly become important since inteins are recognized as useful biotechnological tools for protein ligation. We determined the structures of one of inteins with high splicing efficiency, the RadA intein from Pyrococcus horikoshii (PhoRadA). The solution NMR structure and the crystal structures elucidated the structural basis for its high efficiency and directed our efforts of engineering that led to rational design of a functional minimized RadA intein. The crystal structure of the minimized RadA intein also revealed the precise interactions between N-extein and the intein. We systematically analyzed the effects at the -1 position of N-extein and were able to significantly improve the splicing efficiency of a less robust splicing variant by eliminating the unfavorable extein-intein interactions observed in the structure. This work provides an example of how unveiling structure-function relationships of inteins offer a promising way of improving their properties as better tools for protein engineering.     

内含肽介导的生物学效应及其应用

蛋白质翻译产物在成熟过程中剪切释放出来的一段氨基酸序列称为“intein”---即内含肽。它与前体蛋白以框内融合的形式共同翻译,并内嵌于前体蛋白序列中。内含肽的解离以及内含肽两侧氨基酸序列的连接是在内含肽自身催化作用下完成的。本文将从内含肽的发现、结构特征和作用机理等方面对这种具有特殊意义的蛋白质成熟机制进行较为全面的论述,同时介绍了近年来发展起来的以内含肽介导的蛋白质剪接为基础的蛋白质纯化和改造技术。     

多种S1断裂内含肽的体内交叉反应

断裂内含肽含有两个独立分离的多肽片段(N端内含肽和C端内含肽),它催化蛋白质反式剪接反应,在蛋白质研究与蛋白质工程中已得到诸多实际应用.在蛋白质反式剪接过程中,内含肽的N端内含肽和C端内含肽通过结构互补特异性地非共价组合.然而,Ssp DnaX S1型断裂内含肽的较大C端内含肽片段近来被发现能够与源自其它内含肽的N端内含肽片段交叉反应,表明蛋白质内含子Ssp DnaX具有结构杂交特征.本研究对另外2种S1型内含肽Rma DnaB和Ssp GyrB的较大C端内含肽与不同S1型断裂内含肽的N 端内含肽交叉反应活性进行分析检测.目的是探讨S1型断裂内含肽的结构杂交特征是否具有普遍性.结果发现,Rma DnaB的S1 C端内含肽能够与Ssp GyrB的S1 N端内含肽交叉反应,却不能与Ssp DnaX的S1 N端内含肽交叉反应;与此相似,Ssp GyrB的S1 C端内含肽能够与Rma DnaB的 S1 N端内含肽交叉反应,却不能与Ssp DnaX的S1 N端内含肽交叉反应.此外,某些交叉反应表现出温度依赖性.这些结果对于内含肽的结构 功能关系以及S1型断裂内含肽的应用研究具有重要的意义.