用RFLP和PCR—RFLP技术研究东北虎和华南虎线粒体DNA多态性

采用ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ和ＰＣＲＲＦＬＰ技术研究了东北虎和华南虎的ｍｔＤＮＡ的多态性。在ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ研究中,分离纯化了东北虎和华南虎肝、肾和心脏组织的ｍｔＤＮＡ,用２０种识别６碱基对的限制性内切酶消化,结果只有１种限制性内切酶（ＸｂａⅠ）检测到多态性片段,其余１９种限制性内切酶消化产生的限制性格局在东北虎和华南虎完全一致。在ＰＣＲＲＦＬＰ研究中,用ＰＣＲ技术分别扩增了东北虎和华南虎ｍｔＤＮＡ的控制区（ｃｏｎｔｒｏｌｒｅｇｉｏｎ）,用８种识别４碱基对的限制性内切酶分别对扩增产物进行消化,结果只有１种限制性内切酶（ＲｓａⅠ）检测到多态性片段。ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ及ＰＣＲＲＦＬＰ的结果均提示东北虎和华南虎之间的遗传距离极小。这可能与下列因素有关：两者分布区间无天然隔离屏障;具有强扩散能力;近几百年才被相互隔离。     

幽门螺杆菌的基因分型方法及其应用

近几年,有关幽门螺杆菌（ＨＰ）基因分型方法及其应用的研究取得了很大进展。基因分型方法包括：质粒分型、限制性内切酶分型（ＲＥＡ）、核糖分型、染色体ＤＮＡ脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）分型、多聚酶链反应限制性内切酶消化（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）分型、任意引物ＰＣＲ（ＡＰ－ＰＣＲ）分型、ＰＣＲ单链构型多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分型和核苷酸序列分析等。基因分型方法广泛用于ＨＰ的研究,如基因图的构建、感染复发、耐药机     

AFLP标记及在植物中的应用

ＡＦＬＰ是 1 992年由荷兰Ｋｅｙｇｅｎｅ公司Ｚａｂｅａｕ、Ｖｏｓ在ＰＣＲ和ＲＦＬＰ的基础上发展起来的一种检测ＤＮＡ多态性的新方法[1] ,并于1 993年获得欧洲专利局专利。与ＲＦＬＰ类似 ,ＡＦＬＰ也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测ＤＮＡ多态性的一种ＤＮＡ分子标记技术。由于ＲＦＬＰ是以传统的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交为基础的 ,操作繁琐 ,对ＤＮＡ多态性的检出的灵敏度不高 ,在连锁图上有很多大的空间区。随着ＰＣＲ技术广泛应用 ,对分子标记技术的发展产生了巨大的推动作用。除了ＲＦＬＰ(限制性内切酶酶切片段长度多态性标记 …     

PCR产物的RFLP分析在黄芪亚族（豆科）系统学研究中的应用初探

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）将豆科黄芪亚族７属９种及甘草亚族１属１种植物叶绿体基因组中ｎｄｈＦ和ｐｓｂＡ基因中一段约３．１ｋｂ的ＤＮＡ扩增出来,并摸索出一最佳的ＰＣＲ条件,使得此条带得以特异性扩增,可直接用于限制性内切酶水解。通过对此扩增片段的限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）的初步分析,认为利用ＰＣＲ扩增出的ＤＮＡ进行ＲＦＬＰ分析来探讨植物的系统进化问题在中国现行条件下大有潜力,其方法简单易行,结果     

节丛孢属rDNA ITS区RFLPs分析

利用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法对捕食线虫真菌节丛孢属进行了系统发育研究。以ＩＴＳ１和ＩＴＳ４为引物对该属１０种１２个菌株的核糖体ＤＮＡ转录间区（ＩＴＳ）进行了ＰＣＲ扩增,４种内切酶（ＡｌｕⅠ、ＨａｅⅢ、ＨｐａⅡ、ＴａｑⅠ）酶切。结果表明该属的ＩＴＳ区长度没有明显差异,其长度范围在６５８－７０５之间,酶切图谱能体现不同种间的多态性,根据４种内切酶酶切结果,利用ＵＰＧＭＡ法构建的节丛孢属分子系统树,基于体现     

常用实验用近交系小鼠粒体ＤＮＡ遗传变异的分析

应用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术,研究了分析了国内常用的实验用近交系小鼠线粒体ＤＮＡ（mtＤＮＡ）的品种间遗传变异。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析发现,小鼠mtＤＮＡ的Ｄ－loop、tRNA^Met Glu Ile及ＮＤ３基因核酸序列,在４６个限制性内切酶酶切位点上均无差异;用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析方法对这些小鼠mtＤＮＡ的高变异区Ｄ－Loop的５′及3′端作进一步分析,亦未发现品种间遗传变异。结合mtＤＮＡ具有的母系遗传方式的特点,这一结果提示：常用的实验用近交系小鼠形成中可能只有１种雌性血统起了作用。     

用分子生物学技术对草菇进行菌株鉴别

利用AP-PCR和RAPD技术对三个草菇菌株进行鉴别,其结果与用草菇菌株V34基因文库中的中等重复序列为探针进行限制性内切酶长度多态性分析(RFLP),及对编码核糖体5.8SrRNA的DNA(rDNA)进行PCR扩增后的产物进行限制性内切酶长度多态性分析(PCR-RFLP)的结果相一致。这一结果显示出用这四种方法对草菇菌株进行鉴别具有相似的效果。同时用这四种方法构建的分子生物学标记显示出这三个菌株中的两个菌株在遗传上有着较大程度的相似性。     

糖单孢菌16S rDNA的PCR-RFLP分析

ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析适用于种和种间水平的多相分类研究。文章对ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法应用于糖单孢菌属分类有具体方法进行了探讨;报道了一组适于糖单孢菌属ＰＣＲ－ＰＦＬＰ分析的限制性内切酶,并用这组酶对６株糖单孢菌属分离株进行了研究,进一步探讨了实验菌株在该属的分类地位。同时指出了ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法应用中应注意的问题。     

植物病原真菌中DNA分子鉴定技术

就基因组ＤＮＡ中Ｇ＋Ｃ含量、分子杂交、聚合酶链式反应（ＰＣＲ）、限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）、随机扩增多态性（ＲＡＰＤ）,以及扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）等分子标记技术,在植物病原真菌鉴定工作中的应用情况和发展趋势作了介绍。     

采用PCR-RFLP和RAPD对球壳孢目真菌系统学的研究

对球壳孢目真菌首次采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ进行了系统发育研究。以ＩＴＳ１和ＩＴＳ４为引物对４属１２种２４个菌株的核糖体ＤＮＡ转录间区（ＩＴＳ）进行了ＰＣＲ扩增,４种内切酶（ＡｌｕＩ,Ｈｈａ,ＭｓｐＩ,ＴａｑＩ）酶切,结果表明：主要属的ＩＴＳ区长度不同,同属不同种相同。Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ,Ｐｈｙｌｏｓｔｉｃｔａ,Ａｓｃｏｃｈｙｔａ,ＳｅｐｔｏｒｉａＩＴＳ区长度分别为６３０,５６０,５５０,５４０ｂｐ;酶切图谱属间差别明显,属内种间基本一致,暗示传统的分种可能过细,某些种的成立还有商榷的余地,ＰＣＲ－ＲＦＬＰ对确定疑难种属的地位有重要的意义。３属８种１６个菌株的ＲＡＰＤ结果表明,种内图谱相同或图谱类型相同,而种间明显不同,揭示出过去所划分的种的确存在本质的差别,但是否达到种级的差别还有待于进一步研究     

AFLP分子标记及其在植物育种上的应用

扩增酶切片段多态性（ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＲｓｔｒｉｃｉｔｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,简称ＡＦＬＰ）是由Ｚａｂｅａｕ等１９９２年发明的一项新的ＤＮＡ指纹技术,它结合了ＲＦＬＰ和ＰＣＲ技术的特点,具有ＲＦＬＰ技术的可靠性和ＰＣＲ技术高效性,其基本原理是对基因组ＤＮＡ酶切片段的选择性扩增,ＡＦＬＰ扩增片段的谱带数取决于采用的内切酶及引物３′端选择碱基的种类数目和所研究基因组的复杂性,实验     

中国东部栗疫病菌群体的遗传分化

本实验采用ＲＦＬＰ技术,对中国东部栗疫病菌进行了群体遗传结构的研究,３１３个参试菌株来自１０个省（市）的１６个群体（子群体）,样本人布在北纬２４°Ｎ－４１°Ｎ。各菌株的ＤＮＡ分别用限制性内切酶Ｐｓｔ Ⅰ和ＥｃｏＲⅠ酶切,先后以１０个低拷贝ＤＮＡ探针和１个ＤＮＡ指纹图谱探针进行了杂交和检测。结果表明,两个探针的杂交图谱呈单态性,其他７个低拷贝探针的杂交图谱都呈多态性、指纹图谱探针的检测结果显示,辽宁     

人神经生长因子低亲和力受体（p~（75）NGFR）cDNA的克隆及其在神经细胞中表达活性的初步研究

利用酸性异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法从人胎儿基底前脑中提取总ＲＮＡ,用逆转录与聚合酶链反应相结合的ＲＴ－ＰＣＲ法,扩增出人神经生长因子低亲和力受体ｐ~（７５）ＮＧＦＲ基因ｃＤＮＡ,在限制性内切酶ＳｍａⅠ存在下的连接体系中,将扩增出的ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＵＣ１２的ＳｍａⅠ位或,经限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＰｓｔⅠ酶切鉴定是否插入以及ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定方向。将重组质粒中的ｐ~（７５）ＮＧＦＲ的ｃＤＮＡ再次亚克隆至ｐＵＣ１２载体中后,以其双链ＤＮＡ为模板,用末端终止法测出其全部核苷酸顺序,证实其核苷酸编码的ｐ~（７５）ＮＧＦＲ除两个碱基突变外,其余与文献完全一致。完整的ｐ~（７５）ＮＧＦＲ的ｃＤＮＡ分两步克隆到逆转录病毒表达载体ｐＸＴ－１,经ＰＡ３１７包装细胞株体外包装后、收集病毒上清转染条件不死性大鼠小脑神经细胞系Ｒ２．初步结果表明转染了ｐ~（７５）ＮＧＦＲ的Ｒ２细胞株去除ＮＧＦ培养时出现程序化死亡的典型特征梯型ＤＮＡ带。     

新疆地区盐湖的中度嗜盐菌的16S rDNA PCR—RFLP分析

对来自新疆地区艾丁湖、艾比湖和玛那斯盐湖等盐湖的２８株中度嗜盐菌与９株相关的参比菌株,进行了１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析,这些菌株是革兰氏阴性杆菌,能在０～２５％ＮａＣｌ中生长。在实验中,选用４种限制性内切酶ＡｌｕⅠ、ＨｉｎｆⅠ、ＲｓａⅠ和ＨａｅⅢ,将供试菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ产物进行酶切,用３％的琼脂糖电泳分析酶切产物。结果表明,在７４％的相似性水平上分为３群。群Ⅰ包括新分离的     

植物总DNA样品的快速制备

利用Ｑｉａｇｅｎ微量植物ＤＮＡ提取试剂盒,在１小时内即可从植物组织获得总ＤＮＡ,提取过程中勿需酚／氯仿和ＳＤＳ抽提,操作简便、快捷。所得ＤＮＡ样品的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值在１．７－１．９之间。样品纯度高;该样品不含ＰＣＲ反应抑制剂及其他酶反应抑制剂,可被各种限制性内酶完全降解,适合于ＰＣＲ、印迹、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ和ＲＦＬＰ分析等各种下游应用。     

兔防御素（MCP—1）cDNA的克隆与序列分析

从兔脾脏细胞中分离提取总ＲＮＡ,经反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出兔巨嗜细胞阳离子多肽（ＭＣＰ－１）ｃＤＮＡ,插入经ＥｃｏＲ Ｉ和Ｘｂａ Ｉ双酶切的ｐＵＣＤ１９中,构建了党生质粒ｐＵＣＤＥＦ,进行了限制性酶切鉴定和序列分析,结果在扩增出的ｃＤＮＡ２８８个碱基中,在前片段中有一个碱基与发表的兔ＭＣＰ－１ ｃＤＮＡ序列不同,即第１５７位碱基由Ｇ变为Ａ,导致编码的氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸。该ｃＤＮＡ全     

中国4个民族mtDNA D环多态性研究

本文利用聚合酶链反应限制性片长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）方法,检测了３６名汉族,３０名达斡尔族,３２名鄂伦春族,３０名鄂温克族随机选择正常个体ｍｔＤｎＡ Ｄ环４６５ｂｐＤＮＡ片多性并加以比较。结果表明,ｍｔＤＮＡ Ｄ环该片段的ＲＦＬＰ分析共产生２７种限制性类型,计算出４个民族的ｍｔＤＮＡ Ｄ环平均核苷酸歧异频率,并对４个民族的亲缘关系进行了聚类分析。     

AFLP标记在果树遗传育种研究中的应用

1993年 ,Ｚａｂｅａｕ等发明了一项专利技术 ,扩增片段长度多态性 (ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ,ＡＦＬＰ) ,该技术结合了ＲＦＬＰ技术和ＰＣＲ技术的优点 ,以其高效性和高重复性等特点 ,被广泛应用于多种植物的遗传育种研究。1 .ＡＦＬＰ技术的原理和特点ＡＦＬＰ技术是基于对限制性片段的选择性扩增 ,基因组ＤＮＡ被限制性内切酶切割后 ,将限制性片段末端连上双链接头 ,根据接头序列和相邻的限制性位点序列设计引物对限制性片段进行扩增。扩增产物经电泳检测后再比较其谱带的差异。ＡＦＬＰ…     

板齿鼠线粒体DNA的研究

本文应用ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＢｇｌＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｃａＩ和ＸｂａＩ等１３种限制性内切酶对板齿鼠线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）进行限制性片段长度多态（ＲＦＬＰ）分析,并用双酶解法构建其限制性内切酶图谱。结果表明板齿鼠存在３种ｍｔＤＮＡ单倍型,可通过限制酶ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ和ＡｐａＩ区分,呈现ＤＮＡ多态性和种内遗传变异。与小家鼠、褐家鼠ｍｔＤＮＡ限制性片段的数据相比较,板齿鼠和这两种鼠ｍｔＤＮＡ存在明显差异。板齿鼠ｍｔＤＮＡ限制性内切酶图谱的建立,为进一步系统研究鼠科动物的遗传分化提供了依据。     

RAPD技术及其在微生物学方面的应用

198 0年 ,Ｂｏｔｓｅｉｎ提出ＤＮＡ限制性片段长度多态性 (ＲＦＬＰ)可以作为遗传标记 ,从此开创了直接应用ＤＮＡ多态的新阶段。 80年代后 ,ＤＮＡ多聚酶链式反应 (ＰＣＲ)的发展 ,使直接扩增ＤＮＡ的多态性成为可能 ,并在此基础上产生了许多种新型分子标记 ,诸如扩增片段多态性 (ＡＬＦＲ)、串联重复序列(ＶＮＴＲ)、单链构型多态性 (ＰＣＲ ＳＳＣＰ)、序列特异扩增区域 (ＳＣＡＲ)、随机扩增多态性ＤＮＡ(ＲＡＰＤ)等。而ＲＡＰＤ是较为突出的一种。ＲＡＰＤ是由Ｗｉｌｌｉａｍｓ和Ｗｅｌｓｈ在 1 990年各自独立发现的一种ＤＮＡ多态检…