杆状病毒表达EV71病毒样颗粒的装配、制备纯化与鉴定

将EV71P1和3CD基因片段克隆入同一杆状病毒穿梭质粒Bacmid中,构建出重组杆状病毒表达质粒Bac-mid-P1-3CD;脂质体介导其转染Sf9昆虫细胞获得共表达P1和3CD的重组杆状病毒(AcMNPV-P1-3CD)。用IFA和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析。电镜结果显示P1经3CD切割装配成了大小约为27nm的类球形颗粒(即EV71VLPs)。进一步分析影响杆状病毒表达系统的因素以对表达条件进行优化,结果显示MOI值和时间均可影响目的蛋白的表达,其中时间是主要因素。选择优化后条件利用无血清培养基对贴壁Sf9细胞在多层细胞培养器中进行VLPs的大量表达,密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE结果可见三条大小约为39kD、34kD和26kD的VP1、VP0和VP3特异性条带。纯化后EV71VLPs颗粒结构完好,为下一步EV71蛋白结构的基础研究和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

柯萨奇病毒A5病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定

目的构建柯萨奇病毒A5(coxsackievirus A5, CV-A5)病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),并对其进行纯化和鉴定。方法①将CV-A5 P1和3CD基因序列根据昆虫细胞密码子偏好性,对CV-A5-3487R4/CHN XY/2017株基因进行优化并合成,然后分别克隆至供体质粒pFastBacDual的多角体蛋白启动子(polyhedrin promotor, pPh)和pPl0启动子后,构建pFastBacDual-Pl/3CD重组质粒;②重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli,)DH10 Bac~(TM)中,转座形成重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid, bacmid);③再将重组bacmid转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒并表达CV-A5结构蛋白、组装VLPs。应用限制性酶切、PCR扩增、免疫荧光(immuno-fluorescence assay, IFA)技术对CV-A5 VLPs的蛋白进行鉴定;④再利用蔗糖垫底离心和氯化铯(CsCl)密度梯度离心的方法纯化CV-A5 VLPs,并用SDS-PAGE、Western Blot和透射电镜法进一步检测CV-A5 VLPs的浓度和纯度及颗粒形态。结果 pFastBacDual-P1/3CD重组质粒经限制性双酶切、重组Bacmid PCR鉴定、rCV-A5 VLs PCR鉴定结果显示,均在预期目标处有清晰条带。利用IFA检测重组病毒rBacCV-A5-P1/3CD蛋白,结果可见明显荧光。rCV-A5 VLPs经SDS-PAGE检测到VP0为39 000、VP1为34 000和VP3为27 000;Western Blot检测也可见相应特异性条带。利用透射电镜观察纯化rCV-A5 VLPs,可见直径为23～33 nm的颗粒,形态和大小均与CV-A5一致。结论成功构建了rBacCVA5-P1/3CD重组病毒,并在sf9细胞内成功表达了CV-A5 VLPs,为今后CV-A5 VLPs疫苗的研发奠定了基础。     

EV71病毒中和表位和诺如病毒P结构域嵌合蛋白的原核表达

目的:构建肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)的线性中和抗原表位与诺如病毒P结构域融合基因的重组质粒,在大肠杆菌中表达诺如病毒P结构域与EV71中和抗原表位的嵌合蛋白。方法:根据已报道的3个EV71线性中和抗原表位的氨基酸序列,按大肠杆菌密码子表达使用的偏好性优化和设计各线性中和抗原表位的核苷酸序列,将这些表位以单个或不同的组合克隆至含诺如病毒P结构域和GST标签的质粒中,经测序确认后,分别转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导融合蛋白表达。用GST融合蛋白纯化磁珠对融合蛋白进行纯化,最后通过免疫印迹法确认融合蛋白的表达及嵌合蛋白的抗原性。结果:测序结果表明,成功地构建了含EV71病毒3个单表位和4个串联中和抗原表位的诺如病毒P结构域重组质粒,而且这7个含线性中和抗原表位的嵌合蛋白在大肠杆菌中都以可溶形式得到了表达。免疫印迹分析表达蛋白的抗原性结果表明,表达的嵌合蛋白都能与抗诺如病毒P结构域抗血清反应。除了含单表位的SP55和SP28嵌合蛋白外,其它的嵌合蛋白均能与抗EV71病毒的抗血清反应。结论:成功地在大肠杆菌中表达了诺如病毒P结构域和EV71病毒中和抗原表位的嵌合蛋白,且具有抗原性,这为诺如病毒和EV71病毒的二价疫苗及检测方法的研发奠定了基础。     

脊髓灰质炎2型病毒样颗粒在毕赤酵母内的表达与鉴定

目的构建可稳定表达脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)的整合型重组毕赤酵母,鉴定PV VLPs在毕赤酵母细胞中的表达及组装情况。方法根据毕赤酵母密码子偏好性优化salk株II型P1和3CD基因并连接到p Pic ZA载体,构建p Pic ZA-P1-3CD表达载体;用Bgl II线性化p Pic ZA-P1-3CD载体,电转至毕赤酵母GS115中。通过Zeocin抗性筛选获得整合型重组毕赤酵母,随后用高浓度Zeocin抗性筛选得到高表达菌株。甲醇诱导后,用Western Blot检测目的蛋白表达;蔗糖密度梯度离心纯化PV VLPs并进行透射电镜观察。结果成功构建p Pic ZA-P1-3CD表达载体,获得PV VLPs重组毕赤酵母。Western Blot在重组毕赤酵母裂解上清中检测到目的蛋白的表达;蔗糖密度梯度离心纯化后,在透射电镜中观察到直径为30 nm左右的VLPs,其形态与天然的PV颗粒相似。结论成功构建PV-2型VLPs的整合型重组酵母系统,并在毕赤酵母中组装形成了VLPs,为酵母表达系统中PV VLPs疫苗的研制奠定了基础。     

不同脊髓灰质炎病毒株3CD蛋白酶在昆虫细胞中的表达及其对P1前体蛋白的剪切

目的获得在昆虫细胞中有效表达脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因的重组杆状病毒,为制备脊髓灰质炎病毒样颗粒疫苗提供了科学依据。方法将I型脊髓灰质炎病毒(Mahoney株)的P1基因和3CD基因构建到供体质粒中,通过flash BAC ULTRATM系统制备重组杆状病毒;将Mahoney株的P1基因与Sabin株Ⅲ型的3CD基因组合,用同样方法构建重组杆状病毒。通过接种昆虫细胞草地贪夜蛾细胞(sf-9细胞)对两种病毒进行扩增,再接种昆虫细胞粉纹夜蛾细胞(High five细胞)扩大培养,并通过定量PCR对P1和3CD基因的表达进行验证,利用Western blot检测P1蛋白的表达及被3CD蛋白酶剪切的情况。结果获得了两株稳定表达脊髓灰质炎病毒P1和3CD基因的重组杆状病毒。其中,重组杆状病毒(Bac U-Mahoney-P1-3CD)在感染细胞后,3CD蛋白酶表达量较低,不能有效剪切P1前体蛋白;而重组杆状病毒(Bac U-Mahoney-P1-Sabin PV3 3CD)感染细胞后,3CD蛋白酶的表达量和对P1前体蛋白的剪切效力都有明显提高(P<0.05)。结论将Mahoney株P1基因和Sabin株Ⅲ型的3CD基因的组合构建重组杆状病毒,可有效地在昆虫细胞中表达P1和3CD基因,并且Sabin株Ⅲ型的3CD蛋白酶可有效地剪切Mahoney株的P1前体蛋白。     

口蹄疫病毒样颗粒诱导表达型载体的构建及其BHK-21细胞池的筛获

瞬时表达是目前利用哺乳动物细胞表达口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)衣壳蛋白的主流方法。为实现染色体稳定表达FMDV衣壳蛋白并高效组装出病毒样颗粒(virus like particles, VLPs)，本研究构建了piggyBac (PB)转座-组成型表达、PB转座-四环素(tetracycline, Tet)诱导型表达两套质粒。利用荧光蛋白标记技术，验证了质粒的功能。通过抗生素筛选得到了组成型表达P12A3C (WT/L127P)基因的BHK-21细胞池(C-WT、C-L127P)和诱导型表达P12A3C (WT/L127P)基因的BHK-21细胞池(I-WT、I-L127P)。荧光观察和PCR检测证明了绿色荧光蛋白、3C蛋白酶、反向四环素转录激活因子等基因的稳定整合。Western blotting、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)实验证明了细胞池I-L127P具有更强的衣壳蛋白和VLPs生产能力。本研究首次实现了哺乳动物细胞染色体诱导表达FMDV衣壳蛋白，有助于推动哺乳动物生产FMDV VLPs疫苗的技术工艺，也为构建其他蛋白的哺乳动物细胞诱导型表达系统提供了参考。     

肠道病毒71型2C蛋白原核表达及抗体制备

肠道病毒71型(EV71)的非结构蛋白2C(P2C)在病毒复制周期中起着重要的作用,制备P2C的特异性抗体,对研究P2C的生物学功能以及EV71与宿主相互作用的具体机制有非常重要的意义。实验将2C基因克隆到原核表达载体p ET-28a(+)上,在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达出重组蛋白r P2C,进一步优化原核表达条件,在温度为30℃,诱导剂IPTG浓度为1 mmol/L时,蛋白表达量最高,且主要以包涵体形式存在。直接将获得的r P2C通过SDS-PAGE分离后免疫新西兰兔,制备EV71病毒P2C的兔多克隆抗体。通过Western blot检测,该抗体在110 000稀释比例下仍能很好地识别原核表达的r P2C。同时该抗体也能很好地检测到EV71感染RD细胞中的P2C。因此,实验制备出的抗P2C抗体特异性强、效价高,为后续P2C功能的研究以及EV71病毒检测提供了良好的材料。     

A型塞内卡病毒的病毒样颗粒的制备及其免疫原性分析

为了研制A型塞内卡病毒 (Senecavirus A,SVA) 的病毒样颗粒 (Virus-like particles,VLPs) 疫苗,以SVA田间流行毒株CH-FJ-2017结构蛋白基因序列为研究对象,构建了能够同时表达SVA的3种结构蛋白VP0、VP1和VP3的单个原核重组表达质粒pET28a-SVA-VP031。通过大肠杆菌Escherichia coli表达、亲和层析纯化和体外自组装,获得SVA VLPs。透射电子显微镜鉴定显示,SVA的3种结构蛋白在体外能够自组装成直径约25–30 nm的VLPs,并且动物免疫试验结果表明,该VLPs能够有效刺激豚鼠产生高水平的抗原特异性中和抗体。上述研究结果为SVA VLPs疫苗的研制奠定了基础。     

EV71抗原双元植物表达载体构建及生菜瞬时表达

[目的]构建EV71 P1和3CD基因的双元植物表达载体,通过农杆菌注射渗透法实现在生菜叶片中的瞬时共表达。[方法]根据Gen Bank序列,设计合成EV71 C4亚型P1和3CD基因,分步克隆入植物表达载体p CAMBIA2301,并转化农杆菌LBA4404。农杆菌注射渗透法对意大利生菜叶片进行遗传转化,固相酶联斑点实验和免疫印迹实验检测感染叶片总蛋白提取物,分析外源基因表达效果。[结果]限制酶切验证获得共表达植物表达载体p CAMBIA2301-P1-3CD。感染叶片的外源基因表达产物中具有抗VP1抗体结合活性的蛋白,其分子量约39 k Da。[结论]成功构建EV71 3CD和P1基因双元植物表达载体,其在意大利生菜叶片中的表达产物具有免疫反应性。为利用植物生物反应器生产抗EV71口服疫苗提供了理论和实验依据。     

EV71类病毒颗粒的表达和免疫原性的初步评价

目的:运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建EV71类病毒颗粒,并对形成的类病毒颗粒的免疫原性进行初步评价。方法:构建重组杆状病毒表达载体Bacmid-P1-3CD,转染昆虫细胞sf9细胞系,获得携带EV71病毒结构基因P1和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒AcMNPV-P1-3CD。采用免疫荧光、Western blot及电镜观察等方法检测重组病毒表达产物及形态学特征。表达产物免疫动物后用ELISA、中和试验的方法对其免疫效果进行初步评价。结果:免疫荧光证明有特异性表达产物,Western blot结果可见大小约为39kDa的VP1特异性条带。电镜结果可观察到大小约为27nm的颗粒。免疫动物的血清ELISA抗体效价为1:776,中和抗体效价为1:588。 结论:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能共表达EV71的P1和3CD基因,并能形成EV71类病毒颗粒。 经初步评价,形成的EV71 类病毒颗粒具有较好的免疫原性。     

包膜病毒样颗粒疫苗研究进展

病毒样颗粒(VLPs)是指由病毒一个或几个结构蛋白自行组装成不含病毒基因组且不能复制、不具有感染能力的病毒样蛋白颗粒,形态结构上类似完整病毒,具有与完整病毒相似的免疫原性。VLPs可以分为两大类:无包膜VLPs和包膜VLPs,包膜VLPs被源于宿主细胞的脂质包膜包裹,包膜表面含有保护性抗原纤突。主要就包膜病毒样颗粒疫苗的结构、重组表达及免疫原性等方面的研究进展进行了综述。     

西安地区EV71-VP1基因分析

目的:通过在原核表达系统初步构建EV71-VP1,对西安地区肠道病毒71型(EV71)的外壳蛋白VP1基因进行分析.方法:采集西安地区手足口病患儿的疱液、咽部分泌物进行病毒分离和RT-PCR检测;通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1基因,构建重组表达质粒PQE30/VP1,转化到大肠杆菌BL21中,对VP1基因进行遗传学分析.结果:对肠道病毒71型(EV71)西安地方株VP1基因测序.并将其与阜阳株(序列号为EU913471)相比较,表明我国西安地区EV71分离株与阜阳株有较大差别,核苷酸差异约为4%.结论:西安地方株VPl基因与阜阳株相比,其核苷酸差异较为明显.这将为西安地区EV71的分子流行病学研究以及EV71所致疾病的预防和控制,打下良好的基础.     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达及病毒样颗粒的形成

目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基因,构建重组表达载体PET30a-L1,通过优化表达在大肠埃希菌BL21中可溶性表达L1蛋白,其次采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析后,获得高纯度的的L1蛋白,再通过解聚和重聚获得VLPs。结果全基因优化并截短的HPV18L1蛋白在大肠埃希菌系统中以可溶形式表达,纯化后的蛋白纯度达到90%以上,电镜下观察到直径为60 nm的VLPs颗粒。结论利用大肠埃希菌系统可溶性表达非融合HPV18L1蛋白,并获得均一的VLPs颗粒,为疫苗的开发奠定基础。     

呈现新型冠状病毒RBD抗原病毒样颗粒的表达与鉴定*

目的:以乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg为载体,构建呈现新冠病毒刺突蛋白受体结合域的病毒样颗粒,并鉴定其免疫原性,为新冠病毒疫苗的开发提供新思路。方法:在乙型肝炎病毒核心蛋白氨基酸编码序列第78和81位插入新冠病毒刺突蛋白受体结合域(RBD),并通过柔性linker(G4S)3进行连接,序列优化后将融合基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化表达菌Rosetta,在自诱导培养基中诱导表达,菌体破碎后经蔗糖密度梯度离心,透析浓缩的方法纯化病毒样颗粒。SDS-PAGE、Western blot、透射电子显微镜检测和鉴定VLPs。将制备的VLPs与佐剂等比例混合经皮下免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性抗体,分析该HBc-RBD VLPs的免疫原性。结果:在自诱导培养基中,大肠埃希菌可表达部分可溶的VLPs,经蔗糖密度梯度离心纯化后在透射电子显微镜下可以观察到病毒样颗粒的存在。动物实验表明HBc-RBD VLPs刺激小鼠产生了特异性抗体。结论:在原核表达系统中成功表达了展示RBD抗原的VLPs,并通过小鼠实验初步验证了免疫原性,为新冠病毒疫苗的研发提供了新方向。     

氯霉素乙酰基转移酶基因在家蚕核型多角体病毒P10基因启动子控制下的表达

昆虫核型多角体病毒(NPV)P10基因属于晚期基因,为强启动子所控制,又是病毒复制所非必需的基因。我们对前报的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)P10基因,应用PCR技术进行ATG区定点突变,在ATG被突变的同时形成一个BglⅡ酶切位点,得到一个不含ATG的BmNPV P10基因启动子。将长为230bp的经突变后的BmNPV P10基因5’端(包括启动子所有特征)片段克隆进pMMTV·CAT质粒中,构建成一个CAT基因在BmNPV P10基因启动子控制下的pBmPl0·CAT瞬间表达质粒。该质粒通过转染进入经野生型BmNPV感染的BmN细胞中,CAT得以表达。证明BmNPV P10启动子是比较强的启动子,可以在BmN细胞表达外源基因,具备了作为表达载体启动子的特性。     

miR373和miR542-5p调控肠道病毒71型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制

研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。为了揭示miRNAs是否参与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的感染与复制,研究了miRNAs对EV71病毒在宿主细胞内复制的影响。构建miRNAs靶基因筛选系统,在双荧光素酶报告体系的pMIR载体插入病毒基因,如果插入的基因序列能被细胞内的miRNAs靶向调控,报告基因的表达将发生变化。实验发现EV71病毒5′-UTR基因可能是miRNAs的作用靶标。随后利用miRNAs在线分析软件预测并验证可能作用于5′-UTR基因片段的miRNAs。为了研究miRNAs分子对5′-UTR基因的调控作用是否可以体现在EV71病毒的复制过程中,在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miRNAs mimics,利用Western blotting和real-time PCR实验检验EV71病毒的复制和表达情况。实验结果表明,miR373和miR542-5p可以通过作用于EV71病毒5′-UTR基因从而抑制病毒在RD细胞中的复制和表达。细胞内miR373和miR542-5p可以调控EV71在宿主细胞中的复制过程。研究EV71病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明EV71病毒感染与复制机理奠定了基础。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1全长在大肠杆菌中的高效表达及初步活性测定

目的:重组表达肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1全长,用于研制血清学检测试剂和疫苗研发。方法:在获得EV71全长基因并测序正确的基础上,将外壳蛋白VP1全长基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用双抗原夹心检测技术评价重组抗原与27份EV71抗体阳性血清和18份阴性血清的反应情况。结果:重组EV71-VP1蛋白在大肠杆菌中诱导6 h后可获得高效表达,能与27份EV71抗体阳性血清中的21份发生阳性反应,EV71双抗原夹心检测与中和血清测试结果具有很好的一致性(P0.05)。结论:实现了肠道病毒71型外壳蛋白VP1的高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定了基础。     

肠道病毒71型(EV71)荧光病毒的构建

人肠道病毒71型(Enterovirus,EV71)是引起手足口病的主要病原体。首先利用反向遗传学的方法,构建了EV71全长cDNA感染性克隆,经体外转录、转染RD细胞后成功获得了拯救病毒。随后,将增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入到EV71基因组中构建荧光病毒。结果表明,此荧光病毒不仅可以侵染、复制,在传代的过程中EGFP基因也保持了较好的稳定性,表明其可以作为一种报告病毒应用于高通量的EV71抗病毒药物筛选中。     

兔抗肠道病毒71型截短VP1抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗肠道病毒71型(EV71)截短VP1多克隆抗体,为EV71基础研究奠定基础。方法 RT-PCR扩增EV71VP1-N160基因(480 bp),以p GEX-6p-1为表达载体,构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-VP1-N160融合蛋白,并对其进行纯化。以纯化的GST-VP1-N160融合蛋白作为免疫原,经背部皮下免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价,间接免疫荧光法和免疫印迹检测抗体特异性。结果经双酶切鉴定,表明重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160构建正确;GST-VP1-N160融合蛋白相对分子质量为35 000~55 000,主要为不可溶性包涵体形式,其在大肠杆菌中高效表达;纯化后目的蛋白纯度约为95%,蛋白质量浓度1.9 mg/m L;免疫家兔后,免疫血清效价可达1012,抗VP1-N160多克隆抗体可以识别EV71原核表达的重组蛋白及天然病毒抗原中的VP1,特异性好。结论成功制备了抗EV71截短VP1多克隆抗体。     

人细小病毒B19病毒样颗粒的制备

采用昆虫杆状病毒表达系统,制备人细小病毒B19病毒样颗粒(VLPs)。先通过PCR方法合成细小病毒B19衣壳蛋白基因VP2,将其克隆到pFastBac1质粒,然后转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBac-VP2。利用rBac-VP2感染Sf9细胞表达B19VP2蛋白,通过间接免疫荧光、Western blotting等方法鉴定目的蛋白表达。采用两次超速离心的方法对表达产物进行纯化,纯化产物在透射电镜下可见直径约22nm的VLPs。本研究成功制备了人细小病毒B19的VLPs,为B19感染血清学检测方法的建立提供了参考。