一种利用Taq酶快速标记DNA探针的方法

目的：探索低成本、高效、快速的DNA探针标记方法。方法：以特定引物和16nler的随机引物作为延伸引物,利用Taq酶标记DNA探针。以大肠杆菌Klenow片断随机引物延伸标记法作为对照。点杂交方法检测探针标记效果。结果与结论：Taq酶标记法和大肠杆菌Klenow片段随机引物延伸标记法同样有较好的标记效果,且随机引物或特定引物作为延伸引物均可以合成足够有效的探针。Taq酶标记法是一种低成本、高效、快速的DNA探针标记方法。     

Alpha珠蛋白基因片段表达载体的构建

目的：构建alpha珠蛋白基因片段反义表达载体,抑制重型beta地贫患者alpha珠蛋白基因的过量表达,为重型beta地贫基因治疗打下基础。方法：采用PCR扩增alpha珠蛋白基因片段807bp,反应条件94℃ 30s,68℃ 1min,72℃ 2min,35个循环,然后将所扩增片段用Klenow大片段酶补平PCR产物末端,另外用HindⅢ酶切pLNSX,用Klenow补平后,与补平末段的PCR产物平端连接,转化用CaCl2制备的感受态细胞受体DH5α,用碱法提取所得克隆子质粒,电泳比较质粒大小,再用PCR初筛,最后用双酶切进行鉴定。结果：经过质粒大小比较,PCR初筛,双酶切鉴定,得到6个正向插入重组子。     

利用CMV启动子在CHO细胞中表达人tPA

人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是一种以丝氨酸为活性中心的蛋白酶,它能使特异地与血栓中纤维蛋白结合的纤溶酶原转变为纤溶酶,从而选择性地溶解血栓中的纤维蛋白,因此在临床上具有重要的应用价值。为适于tPA基因在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的高效表达,将tPA cDNA片段从原来获得的重组质粒pMM6005中用HindⅢ和BamHⅠ酶切出,经Klenow酶补平后插入CMV启动子下游     

一种在消除限制酶切点的实验中有效的富集方法

在基因工程的载体构建过程中,常常要遇 到需要消除某些多余的限制酶切点的操作。如 果要消除两个同种限制酶切点中的一个,通常 采用步骤如下：酶切DNA样品、分离部分酶 切后的DNA片段、用DNA聚合酶I Klenow 片段填平切口的粘性末端、再以T4连接酶进行 环化连接、最后进行转化、对转化子进行质粒 DN     

Role of the 5´ → 3´ exonuclease and Klenow fragment of <Emphasis Type="Italic">Escherichia coli</Emphasis> DNA polymerase I in base mismatch repair

We have previously demonstrated that the Escherichia coli strain mutS ΔpolA had a higher rate of transition and minus frameshift mutations than mutS or ΔpolA strains. We argued that DNA polymerase I (PolI) corrects transition mismatches. PolI, encoded by the polA gene, possesses Klenow and 5′ → 3′ exonuclease domains. In the present study, rates of mutation were found to be higher in Klenow-defective mutS strains and 5′ → 3′ exonuclease-defective mutS strains than mutS or polA strains. The Klenow-defective or 5′ → 3′ exonuclease-defective mutS strains showed a marked increase in transition mutations. Sites of transition mutations in mutS, Klenow-defective mutS and 5′ → 3′ exonuclease-defective mutS strains are different. Thus, it is suggested that, in addition to mutS function, both the Klenow and 5′ → 3′ exonuclease domains are involved in the decrease of transition mutations. Transition hot and warm spots in mutS ⁺ polA ⁺ strains were found to differ from those in mutS and mutS ΔpolA strains. We thus argue that all the spontaneous transition mutations in the wild-type strain do not arise from transition mismatches left unrepaired by the MutS system or MutS PolI system.     

病毒ki-ras表达质粒的构建

用重组DNA技术构建了病毒ki-ras表达质粒,用Eco R Ⅰ和Bam H Ⅰ酶解pUC-9DNA,小牛肠碱性磷酸酶脱磷酸,病毒ki-ras编码基因来源于Hi-Hi-3质粒DNA的Sat Ⅱ和Eco R Ⅰ酶切的0.6kb片段,用连接酶和DNA聚合酶Klenow片段将两个片段连接,转化大肠杆菌JM103,免疫筛选表达质粒,从156个转化克隆中得到两株表达质粒,其中一株pKras83的p21蛋白表达量为细菌总蛋白量的10％。     

针对HBV前S2基因三靶位串状核酶的实验研究

我们设计合成了针对HBVaywDNA前S2区第110、122和132位碱基的三靶位串状核酶,观察了核酶对靶基因转录产物的体外切割作用,并将核酶重组到逆转录病毒载体上,转染包装细胞PA317,获取了较高滴度的重组病毒,为进一步研究核酶在细胞内及体内的作用奠定了基础。 核酶基因和靶基因的获取:核酶基因分两个片段进行人工合成,片段间部分互补,通过Klenow酶填补连接成105 bp的全片段,再经     

天花粉胰蛋白酶抑制剂基因的合成与克隆

天花粉胰蛋白酶抑制剂是从中药天花粉中分离出来的一种新的胰蛋白酶抑制剂,其结构最近被测定为含有三对二硫键的27肽,它也是目前发现的最小的多肽类蛋白酶抑制剂。本文报导了天花粉胰蛋白酶抑制剂基因的合成及克隆。设计的合成基因采用了大肠杆菌偏爱的密码子,全长为108个碱基对,它包括了起始密码子ATG,终止密码子TAG和两端的HindⅢ和BamH Ⅰ的识别顺序。整个基因的合成分为两步,首先用化学方法合成四个DNA片段(F1,38mer;F2,30mer;F3,30mer和F4A,46mer),再经连接酶连接成为两个3′端彼此互补的DNA片段(F1+F2,68mer和F3+F4,76mer),最后从两个互为引物的3′端用Klenow酶聚合补齐得到双链基因。同时,用在基因3′端有两个碱基改变的F4B代替F4A,使基因的终止密码子(TAG)变为甲硫氨酸密码子(ATG),并使基因的阅读框架与质粒pUC19中的LaeZ基因相一致,从而实现该基因与LaeZ基因的融合表达。合成基因经DNA序列分析证明其结构正确。     

含SRSV U3区的重组Moloney小鼠白血病病毒的构建及其致病特性

质粒pSF11含有小鼠白血病病毒(SRSV)基因组5kb Bam H Ⅰ片段。应用限制性内切酶分析及Southern印迹杂交技术,确定了长末端重复区(Long terminal repeats,LTR)在pSF11上的位置。pSF11经Bg1 Ⅱ酶解,Klenow酶补平5’粘性末端,碱性磷酸酯酶脱磷后与EcoR Ⅰ Linker连接,转化大肠杆菌C600,经EcoRⅠ酶切筛选得到重组子 pER 1。pER 1经ClaⅠ+EcoR Ⅰ酶切,电泳回收含SRSV LTR的2.55kbDNA,与p63-2(含Moloney小鼠白血病病毒(leukemia virus,M-MuLV)完整基因组)的ClaⅠ+EcoRⅠ14.1kbDNA连接,转化C600受体菌,得到一个M-MuLV 3’LTR被SRSV LTR取代的重组质粒pMS。纯化后转染NIH 3T3细胞,经XC合胞试验及逆转录酶活性测定证明,转染细胞含有M-MuLV与SR-SV的重组病毒MSV,将MSV经皮下接种到新生的NIH Swiss小鼠,通过对小鼠发病阶段血像、大体解剖以及组织病理学检查,发现该重组病毒MSV具有与SRSV极其相似的致病特征。     

随机聚合酶链反应检测未知病毒方法学的建立

目的 探索并建立一种用于快速检测未知病毒的分子生物学方法。 方法 分别以乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）为假定的未知DNA、RNA病毒,验证随机聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）检测未知病毒的可行性。分离HBV、HCV的阳性血清,去除宿主DNA后,提取病毒核酸。锚定随机引物经Klenow酶处理（模板为DNA）或反转录酶作用（模板为RNA）退火至模板,随后用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增。扩增产物经纯化后克隆、测序,最后与BLAST进行比对。结果 经BLAST比对证实,插入序列中有HBV和HCV的基因组片段,在病毒拷贝数为1&;#61620;106拷贝/ml时,被检测克隆的阳性率约为15%。目前我们利用本法能达到的检测低限大致为1&;#61620;104拷贝/ml。 结论 成功建立了一种基于随机PCR的未知病毒检测方法,其优点在于不依赖病毒的细胞培养及其核酸序列信息。此种方法的建立为快速诊断不明原因疾病和新发传染病病原体提供了新的思路。     

来源于家蝇、地鳖虫、黄粉虫和河虾壳几丁糖的基本特性

为了了解昆虫来源几丁糖的基本特性及其与河虾来源几丁糖的差别,用同一方法在相同条件下分别以河虾壳(shell of Procambarus clarkii)、家蝇蛹壳(pupa shell ofMusca domestica vicinaMacquart)、地鳖虫壳(shell of Euplyphaga Walker)和黄粉虫蜕(exuviate of Tnebrio molitorL.)为来源制备的几丁糖在灰份、脱乙酰度、分子质量等及红外图谱上进行比较研究。昆虫来源几丁糖,其灰份低于河虾壳来源几丁糖;家蝇蛹壳几丁糖分子质量明显低于其他3种来源的几丁糖;从几丁糖质量角度看,采用家蝇蛹壳和地鳖虫壳可制备脱乙酰度较高的几丁糖;4种来源的几丁糖红外光谱图谱基本一致,具有几丁糖的特征吸收峰。     

两种pUC18高效T载体的构建

T载体是用于直接克隆PCR产物的线性载体.在此之前,克隆PCR片段时一般先用Klenow片段酶或T4DNA聚合酶削平PCR产物两端,克隆过程中又大都不能使用碱性磷酸酶为载体片段脱磷,因为绝大多数PCR引物5’端未磷酸化,T载体的诞生使分子生物学工作者摆脱了这一窘境,而且,T载体的3’端突出的T碱基与PCR产物3’端由于Taq酶非模板依赖的末端转移酶活性而添加的A碱基[1]互补,使载体与PCR产物的连接效率大大提高.由于具有上述优点,T载体从一产生就引起人们极大的兴趣,很多公司也相继推出了各自的T载体系统,并运用该技术改造了很多传统载体.本…     

球孢白僵菌胞内几丁质酶的分离纯化及性质

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)突变株CH-1316细胞裂解液经(NH_4)_2SO_4沉淀,DEAE-纤维素层析及凝胶过滤,分离出一种几丁质酶,该酶的分子量为32000;最适pH为5.0;最适温度为40℃;最适离子强度为0.2mol/L NaCl;Hg²⁺、Fe²⁺是该酶的强抑制剂;该几丁质酶完全不水解纯的片状几丁质,脱矿几丁质也不是该酶的良好底物;该几丁质酶水解几丁寡糖,但不水解几丁二糖;对几丁五糖以上的寡糖水解速度较快,而对几丁三糖和四糖水解速度则慢得多。     

水溶性医用几丁糖治疗Ⅱ°烧伤创面的临床研究

目的 :采用医用几丁糖 (水溶性 )涂治 (浅、深 ) °烧伤 52例 ,强力碘液对照治疗 °烧伤 1 2例。观察医用几丁糖涂治 °烧伤创面后促进愈合的作用 ,抑制细菌生长和止痛的作用。方法 :凡是住院 °烧伤病员先直接涂几丁糖治疗 40例 ,观察有效后 ,按患者入院顺序随机编入治疗组 (几丁糖 A组 )和对照组 (强力碘 B组 )。创面清洁后分别涂上几丁糖和强力碘治疗。结果 :A组共治愈 52例 ,B组治愈 1 2例 ,其创面平均愈合时间为 ,A组浅 °1 0 .73± 1 .98天 ,深 °2 2 .47± 3.0 6天 ;B组浅 °1 4 .83± 1 .75天 ,深 °30 .33± 4.39天。 A组创面没发生感染 ,B组深 °创面有不同程度感染。A组涂药后疼痛减轻 ,B组创面疼痛加重。结论 :本组临床研究表明 ,A组创面愈合时间显著提前 4- 9天 (与对照组相比 P<0 .0 1 ) ,证明几丁糖确实具有促进创面愈合的作用和抑菌作用 ,同时能减轻创面疼痛     

一种用于基因芯片可靠的双轮RNA线性扩增技术

DNA微阵列能在一次实验中检测成千上万个基因的表达情况, 有助于阐明疾病发生的分子机制及发现新的诊治靶标.但常规方法需要大量RNA, 因而基于T7 RNA线性扩增技术逐渐成为微阵列表达谱实验中最常用的探针制备方法.本方法将实验步骤进一步改进,增加额外的一轮体外转录,并结合Klenow酶标记技术来制备cDNA靶标和寡核苷酸芯片杂交.从纳克量级的总RNA起始,本方法和常规的RNA单轮线性扩增法相比,仍然准确地保留了约70%的基因表达信息.同一RNA样本的自身比较实验及重复实验结果也显示,该方法具有较高的可靠性和重复性.RNA双轮体外扩增法需要的起始RNA相对于常规的单轮扩增法减少了很多（10 ng甚至更少）,因而非常适合分析那些只能提供微量RNA的样本.     

福建的两种花松鼠及其生活习性的初步调查

花松鼠(Tamiops swinhoei)为松鼠科(Sciu-ridae)中体形较小的一种松鼠,因为背毛上有几条暗色的纵纹,故又称为纵纹松鼠。在我国有几种亚种,如分布在云南的 Tamiops swin-hoei clarkei;四川、云南的 Tamiops swinhoeiswinhoei;河北、甘肃的 Tamiops swinhoei vesti-tus;海南岛的 Tamiops swinhoei hainanus 和福建的 Tamiop swinhoei maritimus 等。这些花松鼠的外形大都很相似,只是在毛色上有些差别。根据 Bonhote氏(1900)的意见认为福建的花松鼠(Tamiops swinhoei)为松鼠科(Sciu-ridae)中体形较小的一种松鼠,因为背毛上有几条暗色的纵纹,故又称为纵纹松鼠。在我国有几种亚种,如分布在云南的 Tamiops swin-hoei clarkei;四川、云南的 Tamiops swinhoeiswinhoei;河北、甘肃的 Tamiops swinhoei vesti-tus;海南岛的 Tamiops swinhoei hainanus 和福建的 Tamiop swinhoei maritimus 等。这些花松鼠的外形大都很相似,只是在毛色上有些差别。根据 Bonhote氏(1900)的意见认为福建的     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)C-2总DNA经PstI部分酶切后分离2～10kb的片段,插入质粒pUC19的PstI位点,转化大肠杆菌(Escherichia coli),利用几丁质平板从约8000个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆(命名为pCHT1)。用12种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长3.0kb,其中各有一个KpnI,SacI和SspI位点。把该克隆片段反向插入pUC19的PstI位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Southern杂交证实了该片段来自于B.circulans C-2基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它7株几丁酶产生菌的总DNA杂交。     

明胶—几丁糖膜的制备及其止血性能的实验研究

目的制备几丁糖膜以及研究其止血性能。方法 在透析后的几丁糖与明胶混合液中加入戊二醛交联后置入冻干机冻干制得几丁糖膜。取新西兰兔4只,在背部两侧对称性剪开直径1cm渗血伤口,分别用纱布和几丁糖膜止血,观察与创面的粘附情况,记录出血时间,以膜或纱布中Hb光度吸收值表示出血量。结果 几丁糖膜与创面粘附良好,几丁糖膜组、纱布组的出血时间分别为78.25±6.42秒、119.05±11.39秒,Hb光度吸收值为0.76±0.51、1.63±0.72,明显优于纱布对照组(P<0.01)。结论 几丁糖膜具有一定的止血性能。     

苏联植物生理学文献目录(1949—1951)

本目锋所包括期刊的原名和湃名ArPo6班。几or只只登巢生物鬃B的x“Mn分生物化擎B班ox“M瓦只sePHa敦粒生物化擎BoTaH·狱yPHa几植物擎摊豁B刃几.f几aB.6oTaH.ea及a.德植物圈公辍B刃几几Beeeo幻3H.H一宜·只H·Ta qa兄班ey6, TP0n·Ky几bTyP· 全陈梁集及亚熟带植物研究所公辍B幻几.EPeBaH.6oTaR·ea及a· 挨里温植物圃公毅B玲几.MoeK.06·Ba月en班T.np且Po及班,OT及· 6 HO万.莫斯科自然科攀研究者镶舍公毅,生物 擎部分(科协公报生物)BecTH·AH CCCP·珠哪科李院通报BeeTa么K AH Ka3ax.CCP哈隆克科擎院通报BecTH…     

HCV core 1b 亚型和HA 共表达重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建HCV core 1b亚型和HA共表达的腺病毒载体并予以鉴定。方法:合成HCV核心蛋白1b亚型的核苷酸,连接入pcmv5-HA质粒中。用XhoⅠ单酶切,后用Klenow酶补平,再用HindⅢ单酶切下HA-HCV core 1b片段,连入pShuttle-cmv穿梭质粒中,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-HA core 1b.将pShuttle-CMV-HA core 1b转化至含有AdEasy-1的BJ5183感受态细菌中进行同源重组。PacⅠ酶切线性化重组质粒pAd-HA-HCV core 1b并转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。用RT-PCR检测HA-HCVcore 1b的mRNA的表达水平,并用Western blot检测融合表达蛋白HA-HCV core 1b的表达水平。结果:穿梭质粒pShuttle-CMV-HA-HCV core 1b经PCR和测序证实构建成功。重组腺病毒载体经AD293细胞包装后,可观察到CPE现象。用获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞,经RT-PCR检测,在mRNA水平上有表达;经Western blot检测,HCV core 1b亚型腺病毒载体(Ad-HA-HCV core 1b)感染组与未感染腺病毒载体组及空白对照组相比,只有Ad-HA-HCV core 1b感染组有融合蛋白HA-HCVcore 1b的表达。结论:通过分子克隆体外重组技术,成功构建了HCV core 1b亚型和HA共表达的重组腺病毒载体Ad-HA-HCVcore 1b。为进一步研究丙型肝炎病毒1b亚型引起丙肝感染中胰岛素抵抗的作用机制提供了方法。