奥曲肽对TGF-β1诱导大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响

目的：探讨奥曲肽对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖及凋亡的作用,并了解上述作用是否通过含有SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶1（SHP-1）介导。方法：体外培养大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）,以TGF-β1、奥曲肽、SHP-1抑制剂NSC87877作为工具药。将ASMCs分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+奥曲肽组、TGF-β1+奥曲肽+NSC87877组,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定ASMCs增殖,Western blot检测磷酸化SHP-1的水平。另将ASMCs分为对照组、0.01 nmol/ml奥曲肽组、0.1 nmol/ml奥曲肽组,Annexin V/P I双标记流式细胞仪分析方法检测细胞凋亡。结果：①TGF-β1组ASMCs的增殖反应高于对照组（P<0.01）,TGF-β1+奥曲肽组ASMCs增殖反应显著低于TGF-β1组（P<0.05）,TGF-β1+奥曲肽+NSC87877组的增殖反应显著低于TGF-β1+奥曲肽组（P<0.01）;②0.01 nmol/ml奥曲肽组凋亡率显著高于对照组（P<0.01）,0.1 nmol/ml奥曲肽组与对照组比较凋亡率无显著差异;③TGF-β1组较对照组p-SHP-1水平显著降低（P<0.05）,TGF-β1+奥曲肽组较TGF-β1组p-SHP-1水平稍升高,但差异无统计学意义,TGF-β1+奥曲肽+NSC87877组p-SHP-1水平较其余3组显著降低（P<0.01）。结论：奥曲肽可抑制TGF-β1诱导的ASMCs增生;低剂量奥曲肽促进ASMCs凋亡,较高剂量奥曲肽对ASMCs凋亡无明显影响;奥曲肽抑制ASMCs增生与SHP-1激活无关,可能通过介导生长抑素受体2（SSTR2）作用的其他机制或通过其他生长抑素受体（SSTRs）抑制ASMCs生长。     

TGF-β1对Aβ1-42诱导海马神经元-小胶质细胞共培养体系中细胞因子表达和分泌的影响

目的：探讨在海马神经元和小胶质细胞共培养体系中转化生长因子-β1（TGF-β1）对β淀粉样肽1-42（Aβ_1-42）诱导的小胶质细胞激活表达和分泌细胞因子的影响。方法：将大鼠海马神经元和小胶质细胞进行共同培养,于共同培养后第5日,加入TGF-β1（5 or 20 ng/ml）,1 h后加入Aβ_1-42（5 μmol/L）,继续培养72 h后用于后续实验,Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白表达;Real-time PCR和ELISA法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和胰岛素样生长因子（IGF-1）的mRNA表达和分泌。结果：在共同培养的海马神经元与小胶质细胞体系中,Aβ_1-42诱导炎症因子iNOS、TNF-α和IL-1β的表达和/或分泌上调,神经营养因子IGF-1表达下调,TGF-β1预处理削弱上述Aβ_1-42的作用。结论：TGF-β1明显抑制Aβ_1-42诱导的小胶质细胞激活引起的炎性细胞因子的增加和神经营养因子的减少。     

积雪草对转染TGF-β1基因的大鼠肾小球系膜细胞Smad 2/3、Smad 7和胶原蛋白Ⅳ表达的影响

目的：通过细胞转基因技术,获得稳定表达转化生长因子β1（TGF-β1）的系膜细胞（MC）克隆,观察积雪草（CA）对Smad 2/3、Smad 7和胶原蛋白1V表达及Smad 2/3磷酸化的影响。方法：采用脂质体的方法将TGF-β1表达质粒转入MC细胞,采用G418筛选并建立稳定表达TGF-β1的细胞株。将MC细胞株分为3组：对照组（未转染TGFβ1的MC+RPMI 1640+10%正常大鼠血清）,TGF-β1转染组（稳定表达TGF-β1的MC+RPMI 1640+10%正常大鼠血清）,积雪草（CA）组：稳定表达TGF-β1的MC+RPMI 1640+10%含高浓度CA的大鼠血清。实验重复5次。ELISA法检测各组培养上清中TGF-β1和胶原Ⅳ的含量;RT-PCR方法检测各组细胞TGF-β1、Smad 2/3、Smad 7的mRNA表达水平;Western印迹法检测各组细胞TGF-β1、Smad 2/3、p-Smad 2/3、Smad 7、胶原Ⅳ的蛋白质水平。结果：TGF-β1转染组细胞上清液中的TGF-β1和胶原蛋白Ⅳ水平显著升高,积雪草能显著降低TGF-β1和胶原蛋白Ⅳ水平;TGF-β1转染组细胞中TGF-β1、Smad 2/3的mRNA和蛋白质表达水平及Smad 2/3的磷酸化水平均显著升高,而CA可显著降低MC细胞中TGF-β1、Smad 2/3的mRNA和蛋白质表达水平及Smad 2/3的磷酸化水平;TGF-β1转染组细胞中的Smad 7 mRNA水平显著降低,而CA能使Smad 7的mRNA水平显著升高。结论：稳定表达TGF-β1的MC细胞能激活TGFβ1/Smad信号通路,并引起胶原蛋白Ⅳ表达增加,而CA通过抑制此通路的激活,进而抑制胶原蛋白Ⅳ的表达而减缓糖尿病肾病（DN）的发生。     

贯叶连翘提取物对小鼠免疫性心肌炎心肌纤维化的影响及其机制*

目的:研究贯叶连翘提取物(HPE)对小鼠实验性免疫性心肌炎心肌纤维化(MFEAM)的影响。方法:利用猪心肌肌球蛋白免疫易感鼠系,建立小鼠MFEAM模型,将MFEAM模型组小鼠随机分为: MFEAM模型组(n=14)、HPE100 mg/kg组(n=13)、HPE 40 mg/kg组(n=13)、Cap 50 mg/kg对照组(n=13)。各组药物每次均分别以0.4 ml生理盐水溶解,采用灌胃给药方式,每天2次,共60 d;正常对照组(n=10),MFEAM模型组按上述方法同体积同疗程给予生理盐水。通过观察小鼠一般情况,测定心脏重量、脾脏重量与体重之比,检测小鼠血清中I型前胶原N端前肽(PINP)、III型前胶原N端前肽(PIIINP)含量及转化生长因子-β1(TGF-β1)浓度,Masson染色显微镜观察心肌纤维化(MF)程度及胶原容积分数(CVF)测定,Western blot检测心肌TGF-β1蛋白表达。结果:MFEAM模型组小鼠血清中TGF-β1浓度及PINP、PIIINP含量显著升高,MF程度及CVF增加,心肌TGF-β1蛋白表达上调,与正常组比较差异有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01);而HPE 40 mg/kg、100 mg/kg及Cap对照组血清PINP、PIIINP含量及TGF-β1浓度均减少,不同HPE或Cap剂量显著改善或降低MFEAM模型小鼠MF程度及CVF,不同程度下调心肌TGF-β1蛋白表达水平,与MFEAM模型组比较差异有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01)。结论:HPE对MF有治疗作用,可能与其减少胶原蛋白沉积,抑制TGF-β1信号通路有关。     

TGF-β1诱导的Postn、α-SMA和CollagenⅠ在宫腔粘连内膜组织中高表达与粘连严重程度相关

骨膜蛋白（periostin, Postn）与转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta1,TGF-β1）信号通路活动密切相关,并参与多种纤维化疾病的病理形成,但在宫腔粘连（intrauterine adhesions,IUAs）形成过程中的作用机制尚不清楚。为了解Postn与纤维标志物（α-平滑肌肌动蛋白：alpha smooth muscle actin,α-SMA,Ⅰ型胶原：CollagenⅠ）在宫腔粘连发病中的作用,本研究收集宫腔粘连（实验组）轻、中、重度各20名患者的内膜组织,非宫腔粘连者20名（对照组）,利用实时荧光定量PCR技术、Western印迹技术和免疫组化染色证明：Postn与α-SMA、CollagenⅠ在mRNA和蛋白质表达水平的趋势一致,且与宫腔粘连严重程度呈正相关;实验组Postn、α-SMA 和 CollagenⅠ较对照组明显升高,其中以中、重度宫腔粘连患者内膜组织Postn、α-SMA和CollagenⅠ表达有非常显著的统计学差异（P＜0.01）。同时,为探究TGF-β1与Postn等纤维标志物的关系,利用重组人转化生长因子TGF-β1刺激原代子宫内膜基质细胞后,Western印迹结果显示,TGF-β1与Postn、α-SMA和CollagenⅠ蛋白质表达变化呈现剂量和时间依赖关系。上述结果证实,内膜纤维化是宫腔粘连的主要特征,由Postn等纤维产物参与形成,且与粘连程度相关。推测该病理过程可能与内膜损伤后,TGF-β1促使子宫内膜基质细胞成纤维分化、诱导Postn持续高表达有关。     

积雪草对早期糖尿病肾病大鼠TGF-β1表达及相关下游信号的影响

目的：通过研究积雪草（CA）对早期糖尿病肾病大鼠转化生长因子β₁（TGF-β₁）表达及相关下游信号的影响,阐明积雪草防治早期糖尿病肾病（DN）的分子机制。方法：60只雄性SD大鼠,按体重随机分为假手术组（n=10）和造模组（n=50）。造模组大鼠进行右肾切除术,1周后给以腹腔注射链脲佐菌素（STZ）30 mg/kg,连续给3 d;72 h后测血糖,以 ≥ 16.7 mmol/L,尿糖+++以上及尿量大于对照组的50%为DN模型成模标准。假手术组进行右肾被膜损伤,并注射相应量生理盐水。造模组通过灌胃给药,分为：DN模型组（模型组）、DN+福辛普利组（蒙组1.6 mg/kg·d）、DN+积雪草高剂量组（高剂量组16.8 mg/kg·d）、DN+积雪草中剂量组（中剂量组11.2 mg/kg·d）和DN+积雪草低剂量组（低剂量组5.6 mg/kg·d）（n=10）,连续给药16周,每日上午1次灌胃。利用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测肾组织中TGF-β₁、TβR1、TβR2、Smad2/3、p-Smad2/3及Smad7 mRNA和蛋白的表达。结果：与假手术组相比,DN组TGF-β₁、TβR1、TβR2、Smad2/3 mRNA和蛋白表达及Smad2/3蛋白的磷酸化水平显著增加（P<0.05）、Smad7 mRNA和蛋白表达明显减少（P<0.05）,而福辛普利和高剂量积雪草能倒转DN引起的TGF-β₁、TβR1、TβR2、Smad2/3 mRNA和蛋白表达增加（P<0.05）及Smad7 mRNA和蛋白表达降低（P<0.05）。结论：积雪草可能通过调控TGF-β₁/Smad信号通路起到防治DN的作用。     

结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的高效自发再折叠和再组装

来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16.3以九聚体的形式存在.用三种不同的强变性条件(100℃加热15 min,12 mol/L脲或8 mol/L盐酸胍处理4 h)将Hsp16.3变性, 然后通过冷却或透析使之复性,并利用孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色性光谱比较了变性-复性前后Hsp16.3的各个层次高级结构.结果显示,变性的Hsp16.3几乎可以完全恢复至天然构象,这表明小分子热休克蛋白Hsp16.3具有很强的自发折叠和组装能力.     

分子信标方法研究HIV-1整合酶3'加工反应动力学

HIV-1整合酶催化病毒cDNA与宿主细胞基因组DNA的整合,是病毒在宿主细胞中增殖的一个关键酶。 3'加工是整合酶催化整合过程的第一步反应,3'加工反应动力学的研究对整合酶催化机理研究和以整合酶为靶点的药物研发都具有重要意义。构建了野生型HIV-1整合酶重组质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达,通过对包涵体变性、复性,纯化得到了整合酶蛋白。 基于分子信标原理,设计了荧光和淬灭基团标记的DNA底物,通过荧光信号实时监测3' 加工反应,对酶反应的动力学性质进行研究。 结果表明,纯化的整合酶蛋白具有较高的活性,酶反应表现出显著的Mg²⁺偏好性。 酶动力学研究 (K_m = 131.79 nmol/L,K_cat = 0.0042 min ^-1) 表明,该分子信标方法和设计的DNA底物可用于整合酶3'加工反应动力学研究以及酶反应性质的研究。     

重组人TGF-β3的表达纯化及复性研究

利用大肠杆菌表达重组人转化生长因子β3(humantransformgrowthfactor,hTGFβ3),目的蛋白以包涵体形式表达。用8mol/L尿素溶解的包涵体蛋白,经CMSepharoselFastFlow柱和SphacrylS100分子筛可获得纯度达90%以上的rhTGF-β3单体。将单体蛋白加到复性缓冲液(1mol/LNaCl,0.5mol/LLArg,0.5mmol/LGSSG,30mmol/LCHAPS,20%(v/v)DMSO)进行复性后,再经DEAESepharoselFastFlow柱和SphacrylS100分子筛可分离得到纯度达94%的二聚体rhTGFβ3,纯化后的产量为720mg/L,纯化总回收率为47%。MTT法测活表明,该重组蛋白具刺激成纤维细胞Balb/c3T3生长的作用。     

β-酪啡肽-7保护链脲佐菌素引起的大鼠肾损伤

研究β-酪啡肽-7（β-casomorphin-7,β-CM-7）对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾损伤的保护作用.结果显示：（1）β-酪啡肽-7降低糖尿病大鼠的采食量、饮水量和空腹血糖值,提高糖尿病大鼠的体重,但是差异不显著（P>0.05）.（2）β-酪啡肽-7显著降低糖尿病大鼠尿糖、尿蛋白、血清肌酐、血清尿素氮、肾脏指数和血清中转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量;Masson染色结果显示,β-酪啡肽-7治疗显著降低糖尿病大鼠肾脏的纤维化程度.（3）RT-RCR结果显示,β-酪啡肽-7显著降低糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白基因的表达.Western印迹显示,β-酪啡肽-7显著降低糖尿病大鼠肾脏Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达.上述结果表明,β-酪啡肽-7能够减缓糖尿病大鼠肾脏功能和肾脏纤维化程度,其机制可能与降低TGF-β1含量、减少胶原蛋白在肾脏的沉积有关.     

紫萍磷转运蛋白1;1 cDNA序列的克隆及表达模式

紫萍Spirodela polyrrhiza是一种在生物质资源开发利用和水体生物修复中广泛使用的漂浮植物。随着水体富营养化日益严重,紫萍在水面随处可见。有文献报道紫萍对水体中的氮和磷有良好的净化作用。为了深入研究紫萍对水体中无机磷的吸收和转运,以紫萍为材料提取RNA反转录为cDNA,以此为模板,扩增得到1条特异性片段,其开放读码框 (ORF) 全长序列为1 620 bp,编码539个氨基酸,命名为SpPHT1;1,在GenBank中登录号为MN720003。生物信息学分析表明,SpPHT1;1没有内含子,编码的蛋白是一种稳定的、疏水的、具有11个跨膜结构域的蛋白,其结构具有主要协助转运蛋白超家族 (Major facilitator superfamily,MFS) 保守的结构域,聚类分析显示紫萍SpPHT1;1与玉米ZmPHT2和高粱SbPHT1-8有较近的亲缘关系,推测其属于植物磷转运蛋白家族PHT1成员。正常磷条件,SpPHT1;1在紫萍叶中的表达明显多于根;低磷条件促进该基因的表达,相对表达量在紫萍根和叶生长48 h时均达到峰值;丰磷条件会抑制基因表达,说明SpPHT1;1的表达会受到外界磷浓度的影响。研究结果有助于紫萍磷转运蛋白基因功能的进一步深入研究,为紫萍的进一步开发和利用提供理论依据。     

人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性

目的将前期在大肠埃希杆菌中获得表达的A型人呼吸道合胞病毒兰州分离株截短的F1重组蛋白进行纯化和复性,为后期动物免疫制备抗原。方法 37℃诱导重组菌体p ET-42b-F1J/Rossata,诱导完毕后离心收集菌体,高压破碎菌体并收集包涵体后用不同浓度的Triton X-100(细胞裂解液)洗涤包涵体3次。洗涤的包涵体用8 mol/L尿素进行溶解并用镍离子亲和层析方法进行初步纯化,用阳离子交换层析方法对初步纯化蛋白进行最终的纯化。亲和层析纯化蛋白用3种不同的复性液进行了稀释复性。结果 37℃诱导5 000 m L重组菌p ET-42b-F1J/Rossata共收获37 g湿菌体,经过不同浓度Triton X-100洗涤包涵体后纯度可达75%。包涵体用8 mol/L尿素溶解后经镍离子亲和层析纯化纯度约为40%,再用阳离子交换层析介质SP HP进一步纯化样品后纯度可达90%。纯化蛋白以3种不同的复性液都能得到复性,其中复性液3的复性效果相对较好。结论实验中探索了人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的纯化方法及步骤,为后期的蛋白制备及动物免疫奠定了基础。     

重组融合蛋白Trx-IFN-CSP复性工艺研究

旨在建立并优化融合蛋白Trx-IFN-CSP的复性工艺。对重组融合Trx-IFN-CSP进行体外复性研究,考查p H、温度、蛋白浓度、氧化还原体系及辅助复性小分子等复性条件对融合蛋白重折叠的影响。结果显示,适合Trx-IFN-CSP复性的方法为,反复冻融联合超声破菌获得包涵体;用含有1%Triton X-100、2 mol/L尿素、2%DOC洗涤液初步纯化包涵体;再用6 mol/L盐酸胍溶解液变性包涵体;脉冲加样稀释变性液后4℃条件下梯度透析复性,使用L-Arg辅助复性。经肠激酶切去Trx标签后,每升发酵液最终获得110-130 mg肝靶向干扰素,每批蛋白纯度都在95%以上,比活性在1.9-2.4×108 U/mg之间,制备工艺稳定。     

PGC-1α的功能与代谢病

过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(α subunit of peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator 1,PGC-1α)是过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1 (PGC 1)的成员之一. PGC-1α是与能量代谢 关系密切的1个转录辅助活化因子,在线粒体合成、调节适应性产热、骨骼肌纤维类型转换等过程中发挥重要作用.同时,还 参与到糖代谢、脂代谢中,已成为治疗糖尿病、肥胖等代谢疾病的新靶点.近年来还发现, PGC-1α对治疗癌症发生及神经 变性疾病有一定作用.本文主要从PGC-1α调节适应性产热、促进线粒体合成、在骨骼肌中调节纤维类型转换及葡萄糖代谢 等方面对其生理功能进行阐述,并对 PGC-1α与相关代谢疾病的关系进行了总结.     

一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法

利用8 mol/L尿素溶液对表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白进行变性,通过逐级稀释复性的方法对尿素溶解后的GST-TRAF6融合蛋白进行复性,将复性后的GST-TRAF6融合蛋白进一步利用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析的方法进行分离纯化,将分离纯化后的蛋白通过Western blot方法进行验证,最后利用体外泛素化反应检测经包涵体变性、复性和纯化后的GST-TRAF6融合蛋白的生物学活性。经过包涵体变性、梯度稀释复性和谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析3个步骤后纯化得到纯度达90%以上、浓度为396 ng/μL的蛋白质溶液。利用GST蛋白作为对照,经Western blot验证表明,纯化得到的蛋白确为GSTTRAF6融合蛋白。进一步利用体外泛素化反应分析其泛素连接酶活性发现,17 ng/μL浓度的GST-TRAF6融合蛋白能够以泛素分子作为底物在5 min内快速催化自由泛素链的生成。结果表明,表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白经尿素变性溶解后能够成功复性并分离纯化,在溶解性改变的同时恢复了其泛素连接酶活性。为从大肠杆菌包涵体中大规模分离纯化蛋白质提供了一种新的复性方法。     

益气化瘀化痰方对肺纤维化大鼠的干预作用及其机制*

目的: 探讨益气化瘀化痰方对由博来霉素(BLM)诱导的大鼠肺纤维化的影响及其可能的机制。方法: 采用气管内一次性注射盐酸博来霉素5 mg/kg诱导制备肺纤维化大鼠模型。将60只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、益气化瘀化痰方低浓度组(低浓度组)、益气化瘀化痰方中浓度组(中浓度组)和益气化瘀化痰方高浓度组(高浓度组),每组10只。各中药治疗组在造模4周后分别采用益气化瘀化痰方低、中、高浓度制剂(3.6 ml/(kg·d))灌胃,阳性对照组给予醋酸氢化可的松(3.6ml/(kg·d))灌胃,正常对照组和模型对照组给予同等体积的生理盐水(3.6 ml/(kg·d))灌胃,每日1次。12周后处死各组大鼠,取大鼠肺组织,称量肺质量并计算肺系数,HE染色观察组织形态学改变,Masson染色观察胶原纤维沉积情况;蛋白免疫印迹(Western blot)检测各组大鼠肺组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、锌指蛋白转录因子(Snail1)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、纤连蛋白(Fibronectin)等蛋白表达水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织TGF-β1、Snail1、E-cadherin、Fibronectin等mRNA表达水平。结果: ①与模型组比较,各药物干预组肺系数均有降低(P＜0.05);②与空白组比较,模型组肺纤维化明显;各药物干预组与模型组比较,各治疗组肺间质胶原沉积减少,肺纤维化程度减轻;③治疗各组与模型组比较,各治疗组大鼠肺组织TGF-β1、Snail1、Fibronectin蛋白表达均明显减少(P＜0.05),E-cadherin蛋白表达明显升高(P＜0.05);④低、高浓度组与中浓度组比较,尤以中浓度组表达结果最显著(P＜0.05);⑤中药治疗各组与阳性组比较,表达结果优于阳性组(P＜0.05);mRNA表达与蛋白表达趋势一致。结论: 益气化瘀化痰方能显著治疗博来霉素所致的大鼠肺纤维化,其机理可能是通过下调TGF-β1调控TGF-β/Snail信号通路表达抑制大鼠的上皮细胞-间充质转化,而改善大鼠肺纤维化。     

huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白的复性及纯化研究

利用Q Sepharose H.P.离子交换柱层析在8mol/L尿素变性条件下对huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白进行初步纯化,然后再利用Sephacryl S-200分子筛柱层析复性及纯化后获得目的蛋白,其纯度达到95%以上。该纯化方案成功地解决了稀释复性或透析复性产物在进行Q Sepharose H.P.离子交换柱层析时目的蛋白不稳定而沉积于柱上的问题,获得了较好的复性效果,复性率达到80%以上。使用该纯化方案,1天内便可基本完成重组蛋白的复性及纯化过程,而且也便于扩大。     

抗胰岛素样生长因子1受体单链抗体复性研究

[目的]建立抗人胰岛素样生长因子1受体单链抗体包涵体复性方法。[方法]首先,在96孔板上进行稀释复性,从72种复性液中筛选最佳条件。每孔复性液2 m L,滴入起始浓度1. 5 mg/m L的包涵体溶解液100μL过夜复性。然后,选择最佳复性液与变性液混合在Superdex 75柱上形成1 cm柱长下降5%的变性液梯度,样品按5%柱体积上样进行柱上复性。[结果]最适稀释复性液为C8(50 mmol/L Tris-Cl,GSH/GSSG=5/0. 5 mmol/L,0. 4 mol/L精氨酸,p H 9.0),对应复性率约为78%;以该复性液为基础通过柱上复性,目标蛋白复性率提高到95%,复性样品抗原结合活性良好。[结论]建立了目标蛋白包涵体柱上复性方法,复性率达到95%,产量达到384 mg/L。     

人转化生长因子β1在大肠杆菌中的表达——Ⅰ.胞内直接表达

采用PCR技术 ,扩增了人转化生长因子β1 (hTGFβ1 )成熟肽基因 ,并对其进行了全序列测定 .采用DH5α/ pBV2 2 0表达系统 ,使TGFβ1在大肠杆菌胞内的表达达到 1 6 % .通过N端氨基酸序列测定和免疫印迹分析 ,证实重组蛋白为hTGFβ1单体蛋白 .采用谷胱甘肽法或CHAPS/DMSO法 ,使重组蛋白的复性率达到 30 % .通过纯化获得了银染一条带的重组蛋白 ,MTT法对Mv1Lu细胞的测活表明 ,重组蛋白具有较强的生物活性     

多种翻译后修饰对低氧诱导因子-1α稳定性调控的机制

低氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）是组织细胞对缺氧感应和调控的一类关键转录因子,在机体中广泛表达.作为细胞低氧应答反应中的重要调节因子,HIF-1能够调节100多种涉及低氧应激下细胞适应和存活的靶基因. HIF-1是由氧依赖的α亚基和细胞内稳定表达的β亚基构成的异源二聚体.其中α亚基对氧浓度变化敏感,是HIF-1的功能性亚基,它的表达活性决定了HIF-1的生物学活性.近期研究发现,HIF-1α的一系列翻译后修饰可改变其稳定性,进而调控其转录激活活性,从而参与肿瘤、低氧性肺动脉高压以及心血管疾病等的发生与发展.本文主要就HIF-1α的一列系翻译后修饰,如羟基化、泛素化、磷酸化、乙酰化、SUMO化修饰作一综述.