SEFA-PCR法克隆灵芝鲨烯合酶基因启动子及其序列分析

鲨烯合酶是灵芝三萜生物合成的关键酶,灵芝鲨烯合酶基因的表达和活性的高低决定了灵芝中三萜含量的高低。根据已经获得的灵芝鲨烯合酶全长cDNA序列设计一对专一引物,通过PCR扩增得到了灵芝鲨烯合酶基因的基因组全长,序列长1984bp,含有3个内含子。根据其基因组序列设计引物,采用SEFA-PCR的方法,以总DNA为模板,克隆了灵芝鲨烯合酶基因的启动子序列,长1042bp。序列分析发现灵芝鲨烯合酶基因启动子中没有明显的TATA和CAAT框,但是含有CCAAT-bindingfactor、GATA-1、GC-box、TFⅡD等重要的转录因子的结合位点,以及在人和酿酒酵母鲨烯合酶基因启动子中发现的甾醇调节相关的顺式调控元件。     

茉莉酸甲酯处理雷公藤悬浮细胞的基因差异表达分析

以不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)为诱导子对雷公藤悬浮细胞进行处理,采用cDNA-AFLP技术对差异表达基因进行研究。结果表明,茉莉酸甲酯在50～400μmol/L浓度范围内对雷公藤悬浮细胞总碱的积累呈抑制作用。茉莉酸甲酯处理后,分析筛选出了19个雷公藤悬浮细胞内差异表达的基因。通过与NCBI蛋白质数据库比对,7个片段的功能得以预测,涉及植物细胞的信号转导、转录调控和能量代谢等。这些结果对今后利用生物技术手段提高雷公藤生物碱含量奠定了一定基础。     

乙烯调控灵芝酸生物合成关键基因的筛选

灵芝是我国著名的药用真菌,灵芝酸是其主要活性成分,具有多种药理活性。乙烯可以促进灵芝酸的生物合成,但其调控机理尚不明确。本实验利用非靶向代谢组研究发现Top 20差异代谢物中含有6种灵芝的活性成分(灵芝酸η、赤芝酸F、赤芝酸N、丹芝酸A、灵芝酸V1和灵芝酸δ),其中有4种灵芝酸(灵芝酸η、赤芝酸F、赤芝酸N和灵芝酸V1)为上调积累,2种灵芝酸(灵芝酸δ和丹芝酸A)为下调积累。通过非靶向代谢组与转录组的关联分析发现基因GL23307、GL25546和GL29595同时与3种灵芝酸积累显著相关,并通过启动子顺式元件预测,发现分别编码泛素蛋白和抑肽酶基因GL25546、GL23307的启动子区域含有响应乙烯信号的顺式作用元件GCC-box,因此,推测这两个基因在乙烯调控灵芝酸生物合成中发挥重要作用。     

病毒诱导基因沉默鉴定穿心莲内酯生物合成关键酶ApCPS功能

该研究采用病毒诱导基因沉默技术(VIGS),以生长到第8片真叶期的穿心莲植株为实验材料,沉默参与穿心莲内酯生物合成的ent-柯巴基焦磷酸合酶基因(ApCPS),用半定量和荧光定量PCR检测病毒诱导沉默后ApCPS及其上游基因的表达,用HPLC法检测ApCPS沉默后穿心莲内酯的积累变化,同时检测茉莉酸甲酯(MeJA)处理后ApCPS及上游基因的表达,以全面分析穿心莲内酯代谢以及ApCPS在穿心莲内酯生物合成中的作用机制,验证其在植物体内的功能。结果显示:(1)ApCPS基因被成功沉默,基因表达显著下调,进而引起上游牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GGPS)的表达下调,而3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(HMGR)和1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(DXS)的表达未受影响。(2)ApCPS基因沉默15d后穿心莲内酯积累量显著下降,表明ApCPS是穿心莲内酯生物合成关键酶基因,且能够负反馈影响上游基因表达。(3)茉莉酸甲酯(MeJA)显著诱导ApCPS及上游基因HMGR、DXS和GGPS的表达,表明穿心莲内酯生物合成基因受到MeJA的广泛调控。该研究首次使用VIGS证明ApCPS参与到穿心莲内酯生物合成,为利用该技术鉴定穿心莲内酯生物合成途径中其他基因功能奠定了基础。     

灵芝β-葡萄糖苷酶基因的克隆与功能分析

灵芝是我国著名的药用真菌,具有抗癌、抗肿瘤等功效。灵芝酸属于三萜类化合物,是灵芝的主要活性成分,并已成为评价灵芝品质的重要指标之一。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)是次生代谢产物合成途径中的关键限速酶,能够调节次生代谢产物的生物合成。本研究通过同源序列比对,注释获得了灵芝β-葡萄糖苷酶基因(GlBG),并通过RNAi技术对灵芝β-葡萄糖苷酶进行功能分析。序列分析结果显示GlBG基因的DNA全长为2 759 bp,包含7个外显子和6个内含子,编码793个氨基酸,其编码的蛋白序列中含有β-糖苷水解酶的2个保守结构域。灵芝β-葡萄糖苷酶基因的沉默转化子中灵芝酸含量比野生型菌株的灵芝酸含量平均降低了38%,并且灵芝酸生物合成途径中的关键酶基因(hmgs、hmgr、fps、sqs和osc)的表达量也显著下降,实验结果表明灵芝β-葡萄糖苷酶在灵芝酸生物合成过程中具有重要作用,并为灵芝次生代谢途径及其调控机制提供了参考。     

9,10-环甲基十七烷酸诱导灵芝三萜酸合成的信号转导和基因表达分析

为探究9,10-环甲基十七烷酸（9,10-CMA）诱导灵芝三萜酸合成的相关信号机制,分析了NO信号的介导作用。结果表明,在NO信号分子介导下,9,10-CMA可有效地刺激灵芝菌丝体中三萜合成关键酶细胞色素CYP450和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活化以及三萜酸的合成。NO可作为灵芝菌丝体中CYP450产生和PAL活化的上游分子发挥作用。在9,10-CMA诱导下,通过荧光定量PCR分析了6个关键酶基因在灵芝三萜酸合成过程的动态表达。结果表明,在9,10-CMA诱导下与灵芝三萜酸合成相关的角鲨烯合成酶基因sqs、细胞色素P450单加氧酶CYP5150L8基因和3‐羟基‐3‐甲基戊二酰辅酶A还原酶基因hmgr的上调最显著,提示这3个酶在三萜诱导过程中具有重要作用。     

芍药种子下胚轴休眠相关基因的cDNA-AFLP分析

旨在探讨芍药种子下胚轴的休眠机理,采用cDNA-AFLP技术对层积0 d和根部露白两个时期的芍药种子进行基因差异表达分析。利用256对引物组合进行扩增,筛选获得3 600个差异表达转录衍生片段(TDFs),成功回收到1 200个TDFs,选取500个TDFs对其克隆测序,共得到42个有效序列。经BLAST比对发现,其中30个TDFs与已知功能基因同源,分别参与芍药种子下胚轴休眠过程中的基因表达调控、信号转导、逆境胁迫、物质与能量代谢等过程,9个TDFs与功能未知基因及假想蛋白同源,另有3个TDFs为无同源序列,可能是新的未知基因,这些基因有助于更好地阐明芍药种子下胚轴休眠机理。     

巴西橡胶树HbMKK4基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶的激酶(MKK)基因HbMKK4。该基因全长cDNA序列1 580bp,编码框1 059bp,编码352个氨基酸,含有S_TKc结构域,其编码蛋白的分子量为38.83kD,理论等电点为9.36。实时荧光定量PCR结果显示,HbMKK4在橡胶树的根、树皮、胶乳及叶片中均有表达。割胶、茉莉酸甲酯和乙烯利均能上调胶乳中HbMKK4基因的表达,基因相对表达量分别在割胶后2h、茉莉酸甲酯处理8h和乙烯利处理4h后达到最高。研究结果推测HbMKK4可能通过MAPK信号途径参与茉莉酸信号途径的响应,可能在天然橡胶生物合成调控中起关键作用。     

灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因的克隆及其表达特性

灵芝三萜类化合物是灵芝的重要药用成分,具有多种重要的生理功能,灵芝中三萜含量的高低已成为衡量灵芝质量高低的重要指标。灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因(A hy-droxymethylglutary-l CoA synthase,GlHMGS)作为甲羟戊酸途径中的第一个催化酶,催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA,对于灵芝三萜的合成起着十分重要的作用。分别以灵芝总基因组DNA和反转录的原基cDNA为模板,扩增得到GlHMGS基因的全长DNA和cD-NA序列,该基因DNA全长1 870 bp,其中ORF为1 413 bp,编码471个氨基酸,推测的分子量为51.14kD。通过比对获得的DNA和cDNA序列,发现GlHMGS由5个外显子和4个内含子构成。与NCBI数据库中HMGS的蛋白序列比对发现,GlHMGS与解脂耶罗威亚酵母的HMGS表现出最高的同源性(51%)。进化树分析也表明GlHMGS与真菌亲缘关系最近,这与灵芝的物种分类相吻合。通过酿酒酵母HMGS缺陷的菌株证实所得GlHMGS能够使HMGS缺陷的表型得到互补,证实GlHMGS的功能。利用SEFA-PCR技术扩增GlHMGS基因上游启动子序列,该序列长约1 561 bp,用Softberry等软件对启动子序列进行分析,发现GlHMGS基因启动子中包含有明显的TATA-box和CAAT-box,并发现了多个与甾醇、激素和环境压力等调节相关的顺式作用元件。进一步研究发现,茉莉酸甲酯、脱落酸和水杨酸能够提高GlHMGS基因的转录水平。在研究不同发育阶段和不同碳源对GlHMGS基因的影响时,发现GlHMGS基因的表达水平分别在第16天和以麦芽糖为碳源时达到最大。通过过量表达GlHMGS基因能够显著提高灵芝三萜含量。     

木薯IPT基因的序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯诱导表达特性

木薯是一种重要的能源和淀粉作物,具有较强的抗逆性。为研究木薯中决定细胞分裂素合成的IPT基因如何被逆境信号调控,从木薯基因组数据库中获得了两个Me IPT基因,序列分析显示两者启动子区同时具有茉莉酸和乙烯响应元件。以木薯品种"华南八号"悬浮培养细胞为材料,利用q RT-PCR检测木薯Me IPT1和Me IPT2基因在乙烯利和茉莉酸甲酯处理后的表达模式。结果显示茉莉酸甲酯处理后两个基因显著上调,但乙烯信号对其的影响却不尽相同。这些数据说明这两个Me IPT基因可被乙烯和茉莉酸信号调控,并推测其在进一步影响细胞分裂素的生物合成中可能受整合后的不同激素信号调控。     

扁蓿豆冷诱导基因差异表达分析

以直立型扁蓿豆幼苗为试验材料,采用cDNA-AFLP技术分析扁蓿豆在低温胁迫诱导下的基因表达差异.结果显示,利用筛选的64对引物组合,对0℃低温处理3～5叶期扁蓿豆幼苗的叶片cDNA进行扩增,共获得549条差异表达的转录衍生片段(TDFs).选取上调表达较好的43条片段进行克隆、测序、Blastx比对和功能分析,其中32个TDFs的蛋白序列与基础代谢、信号转导、转录因子、防御等功能有关,11个TDFs为假设蛋白、未知蛋白或没有找到一致序列.利用荧光定量PCR对3种不同上调表达差异片段进行验证,结果可从数值上更准确地显示差异片段在低温胁迫过程中的相对表达量.     

COI1参与茉莉酸调控拟南芥吲哚族芥子油苷生物合成过程

芥子油苷是一类具有防御作用的植物次生代谢产物,外源激素茉莉酸对吲哚族芥子油苷的合成具有强烈的诱导作用,但茉莉酸调控吲哚族芥子油苷生物合成的分子机制并不清楚。以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型和coi1-22、coi1-23两种突变体为研究材料,通过茉莉酸甲酯(MeJA)处理,比较了拟南芥野生型和coi1突变体植株吲哚族芥子油苷含量、吲哚族芥子油苷合成前体色氨酸的生物合成基因(ASA1、TSA1和TSB1)、吲哚族芥子油苷生物合成基因(CYP79B2、CYP79B3和CYP83B1)及调控基因(MYB34和MYB51)的表达对MeJA的响应差异,由此确定茉莉酸信号通过COI1蛋白调控吲哚族芥子油苷生物合成,即茉莉酸信号通过信号开关COI1蛋白作用于转录因子MYB34和MYB51,进而调控吲哚族芥子油苷合成基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1和前体色氨酸的合成基因ASA1、TSA1、TSB1。并且推断,COI1功能缺失后,茉莉酸信号可能通过其他未知调控因子或调控途径激活MYB34转录因子从而调控下游基因表达。     

灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的克隆及超量表达对三萜合成的影响

灵芝Ganoderma lucidum是我国传统的药用真菌,三萜类物质是灵芝的主要生物活性成分,甾醇14α-脱甲基酶是三萜合成途径中的关键酶。根据已报道其他物种甾醇14α-脱甲基酶的氨基酸保守序列设计简并引物,获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶特异基因片段,并进一步获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的全长DNA和cDNA序列。其中DNA序列长1,981bp,cDNA序列长1,635bp。结构基因编码蛋白包含544个氨基酸,分子量为61.99kDa,等电点为6.36。将甾醇14α-脱甲基酶基因的cDNA序列克隆到灵芝超量表达载体pGl-GPD中,利用农杆菌介导的转化法实现了甾醇14α-脱甲基酶基因在灵芝内的超量表达。转化子的甾醇14α-脱甲基酶基因在转录水平表达量增加,三萜含量增加。进一步研究发现,三萜合成途径的关键酶基因Gl-aact、Gl-hmgr及Gl-ls的转录表达量也有所增加。     

基于转录组分析鉴定苹果茉莉素响应基因

为阐明外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的苹果(Malus domestica)抗病分子机制, 以生长30天的Gala组培苗为试材, 用100 μmol?L ^-1MeJA处理叶片12小时, 通过转录组测序, 结合生物信息学分析鉴定出苹果叶片中受MeJA诱导表达的基因。结果表明, 外源MeJA主要影响苹果叶片倍半萜类、三萜和类黄酮的生物合成, 以及芸薹素(BR)信号转导途径间接诱导的抗病性; 倍半萜类、三萜及类黄酮生物合成途径中的关键基因为MDP0000702120和MDP0000692178; MDP0000123379是联系芸薹素信号转导途径和植物-病原菌互作途径的关键调控基因。     

基于转录组分析鉴定苹果茉莉素响应基因

为阐明外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的苹果(Malus domestica)抗病分子机制, 以生长30天的Gala组培苗为试材, 用100 μmol∙L ^-1MeJA处理叶片12小时, 通过转录组测序, 结合生物信息学分析鉴定出苹果叶片中受MeJA诱导表达的基因。结果表明, 外源MeJA主要影响苹果叶片倍半萜类、三萜和类黄酮的生物合成, 以及芸薹素(BR)信号转导途径间接诱导的抗病性; 倍半萜类、三萜及类黄酮生物合成途径中的关键基因为MDP0000702120和MDP0000692178; MDP0000123379是联系芸薹素信号转导途径和植物-病原菌互作途径的关键调控基因。     

东乡野生稻及其渐渗系应答低磷胁迫的基因差异表达分析

以东乡野生稻耐低磷渐渗系IL171及其双亲(栽培稻‘协青早B’和东乡野生稻)为试材,采用cDNA-AFLP技术分析其幼苗期应答低磷胁迫的差异表达谱特征,并采用实时荧光定量PCR分析验证差异表达基因的表达特性,为探究东乡野生稻耐低磷胁迫的分子机制、发掘耐低磷相关的基因奠定基础。结果显示:(1)基于17对扩增效果较好的cDNA-AFLP引物分析发现,不同胁迫时间的参试材料与其对照组(正常磷水平)相比,具有很多(20~159个)上调或下调表达的差异片段。(2)与‘协青早B’相比,IL171中特异性上调的差异带有36条,下调表达61条,而东乡野生稻中分别有79条和136条;IL171与东乡野生稻共有的上调差异带为13条,下调差异带有15条。(3)回收纯化其中60条特异性差异表达条带,最终克隆测序获得50个差异表达基因片段TDFs;通过Blast比对和功能分析,可将TDFs分为8类,包括能量与代谢、基因表达调控、信号转导和转录因子等。(4)实时荧光定量PCR验证其中6个TDFs发现,各差异片段的荧光定量PCR表达模式与cDNA-AFLP结果一致,表明该实验的cDNAAFLP差异表达结果可靠,东乡野生稻的部分耐低磷相关基因已成功导入到渐渗系中,是发掘利用东乡野生稻耐低磷相关基因、探究其耐低磷分子机制的重要资源。     

茉莉酸诱导橡胶树体细胞胚花青素的累积

花青素是一种简单、安全和肉眼直接可辨转基因筛选标记。本研究为了建立橡胶树体细胞胚花青素调控基因发掘的实验体系,探讨了茉莉酸处理方式和时间对橡胶树体细胞胚累积花青素的影响,以及分析了花青素合成关键结构基因在茉莉酸处理前后表达。结果显示140μmol/L茉莉酸甲酯液体培养4 h后,再转移到无茉莉酸甲酯的固体培养基上继续培养,不但能够诱导花青素累积,而且较直接固体培养基添加茉莉酸甲酯,提早1~2 d观察到花青素的累积,同时,累积花青素主要为矢车菊,处理后矢车菊含量提高了5倍以上。再者,花青素合成相关13个结构基因在茉莉酸甲酯处理后均上调表达,尤其Hb LDOX上调表达13.29倍。本研究证实了茉莉酸是诱导橡胶树体细胞胚花青素累积的有效诱导剂,而且Hb LDOX可能是橡胶树体细胞胚花青素累积关键限速步骤。     

冰菜盐胁迫下的转录组分析

为了解冰菜(Mesembryanthemum crystallinum)叶片抗盐相关基因组学,利用Illumina Hi-seq TM2500高通量测序技术研究冰菜叶片在400 mmol L~(–1) NaCl胁迫下转录组基因的差异表达。结果表明,从400 mmol L~(–1) NaCl胁迫和对照的冰菜叶片中共获得13.01 Gb Clean data,Q30碱基均大于90.08%。共获得123个差异表达基因(DEGs),包括73个上调基因,50个下调基因,其中功能注释的基因有96个。根据Unigene库序列进行GO、COG和KEGG注释,筛选出8个与抗盐性相关差异表达基因,植物激素代谢相关基因,脱落酸8'-羟基化酶、吲哚-3-乙酰酸酰胺合成酶和茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白基因均下调表达,生长素响应蛋白、细胞分裂素合酶基因则上调表达,糖代谢相关基因棉子糖合成酶基因上调表达,质膜H+-ATPase基因上调表达,脱水蛋白基因下调表达。这为冰菜耐盐基因组学和分子生物学的研究奠定基础。     

过表达腺苷生物合成正相关基因GlPNP提高灵芝腺苷的含量

【背景】灵芝被纳入我国“药食同源”试点名单，腺苷作为其主要活性物质之一，在免疫调节、抗炎、抗癌等方面发挥着重要作用。【目的】调控腺苷生物合成关键酶基因的表达来提高灵芝腺苷产量。【方法】将不同培养时间阶段腺苷合成酶基因(包括5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶GlATIC、嘌呤核苷磷酸化酶GlPNP、腺苷激酶GlADK)的表达量与腺苷含量相关联，筛选出与灵芝腺苷含量呈正相关的关键酶基因。克隆关键酶基因并在灵芝中过表达，探究关键酶基因过表达对灵芝腺苷积累的影响。【结果】GlPNP的表达与灵芝腺苷含量呈正相关。GlPNP的cDNA全长为969 bp，预测GlPNP蛋白的相对分子量为34.6 kDa，呈三聚体的四元结构。研究结果表明，过表达菌株中GlPNP的表达量在第4天比野生型菌株(WT)上调了2.9-3.9倍，与含空载体的菌株(CK)相比，腺苷含量分别提高了78%和63%。【结论】过表达嘌呤核苷磷酸化酶是提高灵芝腺苷产量的一种有效手段。     

茉莉酸作用的分子生物学研究

茉莉酸及其衍生物茉莉酸甲酯等统称为茉莉酸盐,是广泛存在于植物中的一种生长调节物质,在植物细胞中起着非常重要的作用。介绍了茉莉酸生物合成过程中关键酶基因的克隆、表达及调控,并对茉莉酸的一些突变体进行了分析,结果 显示茉莉酸在发育及防御尤其是在雄性不育及抗病虫害方面起着非常重要的作用,同时综述了茉莉酸信号转导的最新成果。