产石杉碱甲内生真菌的复壮及产量提高研究

【目的】千层塔中分离得到的内生真菌胶孢炭疽Cg01可合成石杉碱甲(huperzine A, HupA)，但产量较低，且随着继代的增加，产量下降，菌株退化严重。研究表明，表观遗传修饰与次生代谢产物的合成密切相关。本研究旨在提高HupA的产量，改善退化菌株的品质，并从表观遗传修饰的角度探讨次生代谢产物合成的机理。【方法】通过改变培养基碳源、添加生物诱导子，根据胶孢炭疽Cg01的菌落形态、菌丝生长速度、生物量及HupA产量等筛选复壮培养基；添加不同浓度的组蛋白甲基化转移酶抑制剂，检测HupA的产量，筛选提高HupA产量的小分子抑制剂；检测相关表观遗传修饰基因的表达。【结果】添加同源刺激物千层塔茎叶汁，对胶孢炭疽Cg01的菌落形态、生长速度、形态特征及生物量无显著影响，但可提高HupA的产量，传代至第5代时为对照组的1.67倍(125.7 μg/L)。添加千层塔茎叶汁能显著降低组蛋白甲基化转移酶Cg12377、组蛋白去乙酰化酶Cg15620、DNA甲基化转移酶Cg02440基因的表达，提高组蛋白去乙酰化酶Cg02312基因的表达。UNC0224对内生真菌胶孢炭疽菌的HupA产量无显著影响；2‒15 μmol/L BRD4770能显著提高HupA的产量(169.57‒152.10 μg/L)。BRD4770组处理后，相关表观遗传基因Cg12377、Cg02440、Cg02312和Cg15620的表达量都显著下降。【结论】添加千层塔茎叶汁培养胶孢炭疽Cg01可维持其合成次生代谢产物的能力；添加组蛋白甲基化转移酶抑制剂BRD4770可提高HupA的产量。本研究为解决内生真菌大规模生产过程中的菌株退化问题提供了参考，并为组蛋白甲基化影响次生代谢产物的合成提供了依据。     

过表达腺苷生物合成正相关基因GlPNP提高灵芝腺苷的含量

【背景】灵芝被纳入我国“药食同源”试点名单，腺苷作为其主要活性物质之一，在免疫调节、抗炎、抗癌等方面发挥着重要作用。【目的】调控腺苷生物合成关键酶基因的表达来提高灵芝腺苷产量。【方法】将不同培养时间阶段腺苷合成酶基因(包括5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶GlATIC、嘌呤核苷磷酸化酶GlPNP、腺苷激酶GlADK)的表达量与腺苷含量相关联，筛选出与灵芝腺苷含量呈正相关的关键酶基因。克隆关键酶基因并在灵芝中过表达，探究关键酶基因过表达对灵芝腺苷积累的影响。【结果】GlPNP的表达与灵芝腺苷含量呈正相关。GlPNP的cDNA全长为969 bp，预测GlPNP蛋白的相对分子量为34.6 kDa，呈三聚体的四元结构。研究结果表明，过表达菌株中GlPNP的表达量在第4天比野生型菌株(WT)上调了2.9-3.9倍，与含空载体的菌株(CK)相比，腺苷含量分别提高了78%和63%。【结论】过表达嘌呤核苷磷酸化酶是提高灵芝腺苷产量的一种有效手段。