海藻糖合成酶活性受固定化处理过程影响的研究*

在麦芽糖苷基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)双酶的作用下,淀粉可转化为海藻糖,但是其转化率较低。中采用多种固定化载体进行酶固定化研究,发现通过经戊二醛与壳聚糖交联后的载体与酶液作用,可吸附与海藻糖合成无关的杂酶和杂质,从而提高海藻糖合成酶的活性。通过比较固定化过程中与反应条件中多个因素的影响,得到了如下最佳作用条件：将酶液与经3％戊二醛交联18h后的滤纸作用18h,再与10％的淀粉溶液反应9h,与未经固定化作用比较,海藻糖的产率提高10倍,达到27．22g／L转化率从5．33％提升到54．43％。     

硫矿硫化叶菌MTSase和MTHase基因的克隆与表达

从嗜热硫矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)ATCC35092的基因组中用PCR方法扩增得到编码MTSase和MTSase的基因,分别将其插入原核表达载体pTrc99a中,并转入大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达。MTSase和MTHase酶活产率达到了31.3U/g(wetcell)和403U/g(wetcell)。在75℃,pH5.0条件下,两酶联合作用转化淀粉生产海藻糖,当淀粉浓度为15%,DE值为10时,海藻糖转化率最高为53.6%。     

嗜酸热硫化叶菌麦芽寡粉基海藻糖合酶基因的克隆和表达

The gene of MTSase (maltooligosyltrehalose synthase) from Sulfolobus acidocaldarius ATCC49426 was amplified by PCR. The primers were designed according to the published sequence of homologous gene from Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909. This gene was inserted into the plasmid pBV220 and the resultant recombinant plasmid pBV220-GT was transformed to E. coli DH5 alpha. The activity of recombinant enzyme was about 10 u/g(wet cell). In order to improve the expression level of target protein, some nucleotides in the 3' and 5' of the gene were modified to optimize the second structure of mRNA by PCR amplification using the new primers devised according to the biosoftware GOLDKEY2.0. As a result, the activity of recombinant enzyme increase to 19.8 u/g(wet cell). Then, the helping plasmid pUBS520 which carried the gene encoding the tRNA of rare codons AGG and AGA was transformed to the recombinant strain. But it took little effect.     

藤黄微球菌海藻糖生物合成基因的克隆与鉴定

首次从一株能利用淀粉产生海藻糖的藤黄微球菌中克隆了海藻糖生物合成基因。采用PCR方法结合非随机鸟枪法得到藤黄微球菌中低聚麦芽糖苷基海藻糖合成酶(MTSase)基因(MtreY)的全序列及低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)基因(MtreZ)的部分序列,其中MtreY共有2,370个碱基,编码789个氨基酸,表达产物分子量为86·7kD。同源性分析表明,与已报道的MTSase和α-淀粉酶家族成员具有相同的保守模体。将MtreY基因在大肠杆菌JM83中表达,证明表达产物具有预期的酶活性。     

海藻糖微生物酶法合成机制的研究

来源于嗜酸热古菌芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12的麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(MTHase)基因在大肠杆菌中获得表达。将获得纯化的两个酶,分别以麦芽寡糖和淀粉为转化底物,在pH5.5,60℃条件下合成海藻糖。从反应产物分析结果可知,两个酶合成海藻糖时能利用的最小底物是麦芽四糖,海藻糖产率与麦芽寡糖链长正相关。同时还发现两个酶都具有轻微的α-1,4-葡萄糖苷酶活性,能在麦芽寡糖还原末端水解α-1,4糖苷键,生成葡萄糖分子,其反应最小底物分别是麦芽三糖和四糖。推测海藻糖合成酶可能有两个不同的催化活性中心。