天然抗凝血酶多肽研究进展

凝血过程与血栓性心脑血管疾病密切相关。人们从多种途径出发去寻找抗凝血药物，其中从天然吸血动物体内提取抗凝血物质并克隆其基因进行人工表达是一重要的方法。本文对业已发现的13种天然抗凝血酶抑制剂、凝血酶的结构及其与抑制剂的相互作用的研究进展和天然抗凝血酶抑制剂的应用前景进行了综合评述。     

大胡蜂蜂毒中多肽和蛋白质结构和功能的多样性

为证明大胡蜂Vespa magnifica(Smith)蜂毒具有较大的药用开发价值,本研究采用超高效液相色谱-质谱和电泳技术对其多肽和蛋白质的分布进行分析,发现其蛋白质的相对分子质量主要分布在17~45kDa范围内。蜂毒多肽类物质的相对分子质量呈"单峰"式分布,61%在500~3000Da范围内,为大胡蜂蜂毒中多肽含量最为丰富的部分。通过牛津杯法对蜂毒的抑菌活性进行研究,且以HepG2人肝癌细胞及B16黑色素瘤细胞为研究对象,用MTT法检测蜂毒的细胞毒性活性,证明其具有良好的抑菌作用和细胞毒活性,其结果与已报道的其他蜂类既有相似性又存在具体差异,展示了大胡蜂蜂毒的分子多样性,为后续该毒素的物质基础研究及药用价值开发提供参考。     

以Candin为佐剂的人乳头瘤病毒多肽 治疗疫苗诱导小鼠的体液免疫应答

目的研究以Candin为佐剂的人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)多肽治疗疫苗诱导小鼠产生的体液免疫应答。方法分别采用PBS(对照)、佐剂Candin(150μL/只)、HPV16 E7多肽[3个E7多肽片段,50μg/(段·只)]和包含佐剂Candin与HPV16 E7多肽的疫苗对C57BL/6小鼠进行免疫接种实验,在第21天和第42天各加强1次免疫,剂量同第1次免疫。第3次免疫后2周,颈脱位处死小鼠,取血清。以ELISA法检测血清总IgG、IgG1和IgG2a抗体浓度。结果经多肽(P=0.001,P0.001)和疫苗(P=0.001,P=0.008)免疫的小鼠总IgG抗体、IgG1抗体水平均较对照组高,差异有统计学意义。与对照组相比,疫苗(P=0.008)可明显提高小鼠血清中IgG2a抗体水平。结论包含佐剂Candin及HPV16 E7多肽的疫苗能诱导小鼠产生明显的体液免疫应答。     

抗肿瘤多肽的研究新进展

抗肿瘤多肽具有分子质量小、特异性高、免疫原性低、生物利用度高等优点,且易于合成和改造,其在肿瘤治疗领域的应用研究近 年来受到广泛关注。目前,已有多种抗肿瘤多肽及其衍生物上市或进入临床研究,对于肿瘤的临床治疗具有重要价值。综述抗肿瘤多肽在 诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤细胞生长和转移以及用作疫苗和药物载体等方面的研究新进展。     

反相C18固相萃取小柱用于蛋白质组分析中少量样品预处理

针对少量且复杂蛋白质组样品,开发一种耗时短、操作简便的分离方法。以人的脑海马组织蛋白样品为研究对象,采用反相C18固相萃取小柱,采用不同乙腈浓度对酶切后样品进行梯度洗脱,与反相高效液相色谱法对比分离效果。通过比较不同乙腈梯度洗脱方案所鉴定到的谱图数、非冗余多肽数、蛋白数和各洗脱组分间重复率分析,确定一种样品量少、简单易行、分离效果好的实验方案。虽然反相C18固相萃取小柱法鉴定蛋白总数占高效液相色谱法的85.5%,但其操作简单,耗时少。通过4种不同乙腈浓度方案比较,确定乙腈洗脱浓度优化为5%、15%、20%和90%时,分离30μg人的海马多肽混合物可以得到较优的分离效果。其蛋白鉴定数为反相液相色谱法的67.0%,且重复性良好。该结果证实反相C18固相萃取小柱分离效果比反相高效液相色谱法稍差,但此方法可以分离少量复杂蛋白质组样品。该方法分离样品充分,操作易行,耗时短,是进行蛋白质组学分析中少量样品的一个简便预处理方法。     

十字花科多肽激素类基因RALF的同源基因克隆及进化分析

多肽激素类基因是对植物生长发育起重要作用的一类基因,RALF是其中的重要一员,而十字花科在中国蔬菜作物中是重要的一大类群。为了摸清十字花科多种蔬菜作物的RALF同源基因信息,该文根据前期研究从油菜中扩增到的多肽激素类基因RALFbn的序列设计引物,从提取的十字花科芸薹属、萝卜属、蔊菜属、山芥属的7份重要蔬菜作物的基因组DNA中分别克隆到了RALF的同源序列。结果表明:7种蔬菜作物的RALF同源基因编码区均在300 bp左右,且无内含子,编码的蛋白质由79个氨基酸组成,说明RALF在十字花科4个属内的保守性较强;对RALF同源基因在十字花科4个属中的表达分析表明,该类基因在根、茎、叶、花序轴等营养器官中不表达或弱表达,但主要在生殖器官中表达,其中在总花蕾和开放花中的表达量普遍高于嫩角果中的表达量,表明该类基因在十字花科中的生理活跃期是花发育时期。同时,构建了十字花科4个属中RALF同源基因的系统树,芸薹属的油菜、甘蓝和芥蓝形成一个分支,而茎瘤芥和分蘖芥形成另外一个分支,且与萝卜属、山芥属、蔊菜属的材料聚在一支,该基因的进化途径在一定程度上也反映出这几种作物的遗传背景关系。该研究结果丰富了RALF家族信息,增添了十字花科植物的分子进化数据。     

重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系,建立表达及纯化重组AIK的最优条件,为深入研究和利用AIK奠定基础。首先,设计含AttB重组位点的引物,通过重叠PCR技术扩增出Att B-TEV-FLAG-AIK序列,利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中,构建入门载体,再通过LR重组反应,将目的序列转移到目的载体pDEST15中,构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后,在BL21(DE3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白,再以rTEV酶切除GST,获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21(DE3)工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(OD600=1.0)4 h,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之,本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒,实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达,经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽,为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。     

单纯疱疹病毒2型感染细胞多肽27真核表达质粒的构建及表达

为了构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)感染细胞多肽27(ICP27)真核表达质粒,应用PCR技术从HSV-2 333株的基因组中扩增ICP27基因,并连接至真核表达载体pEGFPC2,对阳性克隆进行菌落PCR、酶切和测序鉴定后,成功构建了重组质粒pEGFPC2-ICP27。用X fect转染试剂盒将重组质粒pEGFPC2-ICP27转染至Vero细胞中,并用RT-PCR及W estern b lot-ting检测其表达情况。结果显示,ICP27基因在Vero细胞中得到正确表达。真核表达质粒pEGFPC2-ICP27的构建成功,为进一步研究ICP27对宿主细胞的影响奠定了基础。     

军事医学科学院蛋白质组学研究进展

蛋白质组学是后基因组时代生命科学研究的热点和前沿领域.军事医学科学院是国内最早开展蛋白质组研究的单位之一,其蛋白质组学研究的发展不仅对中国蛋白质组研究起到重要的引领作用,也对国际蛋白质组学的发展做出了重要贡献.本文将重点介绍军事医学科学院的科学家在国际人类肝脏蛋白质组计划以及疾病蛋白质组、病原微生物蛋白质组等领域的研究成果.