百合病毒的DNA芯片检测技术研究

根据已知的黄瓜花叶病毒,百合无症病毒、百合斑驳病毒基因核苷酸序列,设计引物和探针,制备寡核苷酸芯片。用Cy3标记核苷酸引物,不对称RT-PCR扩增产物与芯片上的寡核苷酸探针杂交,荧光扫描仪检测并分析信号。研究制备的基因芯片能够检测侵染百合的3种重要病毒核酸的特异性荧光信号,该项技术具有特异、灵敏、快速的优点。     

应用多重标记引物增强寡核苷酸芯片的荧光信号强度

寡核苷酸芯片技术是一种高通量发掘和采集生物信息的强大技术平台,目前已广泛应用于生物科学领域 . 为改善寡核苷酸芯片的分析性能,对影响芯片杂交结果的因素,如片基表面的化学处理、探针的长度、间隔臂的长度、杂交条件等,进行了深入的研究和优化 . 对寡核苷酸芯片而言,仍有待解决的问题是如何产生更强的荧光信号来改善其检测灵敏度 . 利用两种类型的多个荧光分子标记的引物,来增强二维寡核苷酸芯片平面上的荧光信号强度 . 两种引物分别命名为：多标记线性引物和多标记分支引物 . 通过增加标记在目标 DNA 片段上的荧光分子数,可以显著增强寡核苷酸芯片上相应捕获探针的信号强度 . 实验表明,使用多标记引物能将所用的寡核苷酸微阵列的检测限 ( 以能够检测的最低模板量计算 ) 降低至单荧光标记引物的 1/100 以下,多重标记技术是一种有效增强微型化探针矩阵检测灵敏度的信号放大方法 .     

Gaussia分泌型萤光素酶的研究进展及其应用

Gaussia分泌型萤光素酶是近年发现的一种来源于海洋桡脚类动物Gaussia princeps的新型分泌型萤光素酶,是目前已知的可自然分泌的最小萤光素酶,因其分子小、灵敏度高、半衰期短和可高效分泌,而成为一种理想的报告基因,广泛应用于体内外研究。我们就Gaussia分泌型萤光素酶的发光原理、荧光特性及其应用等进行简要综述。     

基于固态基底的SERS免疫检测新方法研究

目的:通过引入新型表面增强拉曼散射(SERS)检测探针(Au-DTNB-Tyr NPs)和金标银染技术,建立基于固态硅片基底的SERS免疫检测新技术。方法:羊抗人IgM-HRP作为检测抗体,在硅片基底上检测不同浓度的人IgM,HRP催化SERS检测探针沉积,利用金标银染技术增强SERS信号。结果:所建立的SERS免疫检测新方法检测人IgM的检测限为10 pg/mL,且SERS信号强度与人IgM浓度具有良好的线性关系(R2=0.993)。结论:基于硅片基底的SERS免疫检测新技术可高灵敏地定量检测人IgM,为实现固态硅片基底对多种抗原的高通量集成化检测奠定了基础。     

丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片质控参比品的建立及质量验证

建立能同时检测丙型肝炎病毒(HCV)嵌合抗体、核心抗体和NS3、NS4、NS5抗体的蛋白质芯片质控参比品,对质控合格的芯片进行质量验证。用3种HCV EIA试剂分别检测从3家医院收集的丙型肝炎病毒感染患血清及其他非HCV感染患血清,从3种EIA试剂同时阴性或阳性的血样中挑取阳性和阴性血清,然后用RNA hyb PCR试剂进行检测,从中再选取部分样本用RIBA3．0进行检测,确定HCV分片段抗体检测蛋白质芯片质控参比品。经质检合格的芯片用中国药品生物制品检定所的HCV参比品进行检定。通过490例临床标本的检测对芯片的质量进行进一步的验证。从收集的240份丙型肝炎病毒感染患血清及其他非HCV感染患血清筛选出30份血样(15份阳性,15份阴性)作为HCV分片段抗体检测蛋白芯片质控参比品。中国药品生物制品检定所的80份HCV参比品检定结果表明,混合抗体阳性检出率为39／40,阴性符合率为40／40,总符合率为98．7％;核心抗体阳性检出率为27／40,阴性符合率为40／40;NS3抗体阳性检出率为26／40,阴性符合率为39／40;NS4抗体阳性检出率为19／40,阴性符合率为40／40;NS5抗体阳性检出率2／40,阴性符合率为40／40。490例临床标本的检测结果表明,对于194例HCV阳性标本,蛋白质芯片混合抗体与ELISA的符合率达99．5％,分片段抗体符合率达97．4％,两种方法检测结果不符的标本经RIBA试剂确认,蛋白质芯片与RIBA试剂的符合率高度一致。对于296例各种HCV抗体阴性标本,蛋白质芯片检测结果全部为阴性。以上结果表明,制备的丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片质控参比品可用于芯片生产的质量控制,经质控合格的芯片符合国家标准的要求,可用于临床检测。     

重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者血清发生特异反应

N蛋白是SARS CoV病毒基因组编码病毒核衣壳蛋白 ,它不同于现已知的任何蛋白质 .对它的深入研究对揭示SARS -CoV的致病机理和疫苗及诊断试剂的研制有重要意义 .灭活的病毒经逆转录后 ,用根据已知的病毒的基因组序列所设计的引物PCR扩增N蛋白基因 .扩增出的基因经序列分析表明和已知的序列完全一致 ,共编码 4 2 2个氨基酸残基 .将N蛋白基因克隆入原核表达载体pET2 8a构建成表达质粒pET2 8a N .表达质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,并用IPTG诱导后 ,获得了高表达N蛋白的重组菌株 .目的蛋白经一步金属离子螯合层析纯化后获得了纯度超过 90 %的样品 .Western印迹及ELISA分析表明 ,SARS患者体内有特异性的针对N蛋白的抗体 ,并具有较高的特异性 .这为临床上诊断SARS患者提供了新方法 ,并为SARS疫苗的研制提供了研究思路     

浙江地区青霉素耐药肺炎链球菌PBPs基因及氨基酸序列研究

为阐明温州地区青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）的青霉素结合蛋白（PBPs）的基因和氨基酸序列的变异特点,对温州医学院自2000年11月～2004年1月收集的26份肺炎链球菌进行分离、鉴定及青霉素药敏实验,并对每株链球菌的PBP1A、PBP2B、PBP2X基因进行PCR扩增和直接测序,通过序列比对与生物信息学分析。结果表明,研究中的PBP1A的主要突变位点是保守基序KTG之后的4个连续氨基酸替换Thr574Ala、Ser575Thr、Gln576Gly、Phe577Tyr和保守序列STMK内的氨基酸替换Thr371Ser;PBP2B的主要突变位点是保守序列SSN之后的氨基酸替换Thr451Ala;PBP2X的主要突变位点是保守基序STMK 内的氨基酸替换Thr338Ala。以上突变类型以及菌株的青霉素耐药水平与文献报道相符。研究检测的PRSP的PBPs基因中暂未发现本地区特有的（新的）基因突变,也未检测出文献报道的某些与青霉素抗性相关的氨基酸替换。     

用于检测葡萄球菌肠毒素的免疫芯片技术

免疫芯片是指包被在固相载体上的高密度抗原或抗体微点阵 ,是继基因芯片之后提出的一种新型的生物芯片。在检测大分子物质葡萄球菌肠毒素 (SE)时采用双抗体夹心法。检测时将SEA、SEB、SEC加入反应池中 ,反应后清洗掉未结合的SE ,再加入相应的标记抗体 ,形成固定抗体 待测物 标记抗体的夹心式结构。对影响免疫芯片检测效果的条件进行了优化 ,按优化后的条件进行SEA、SEB、SEC的检测 ,结果表明荧光信号强度随待测物浓度的增加而增加 ,当浓度高于一定值时 ,荧光信号强度趋于一定值 ,本法最低可检测 0.0 1 μg ml的SEA和SEB及 0.1 μg ml的SEC。将此项技术应用于环境和食品中污染物检测领域 ,将会使卫生监督工作水平得到明显的提高。     

乙型肝炎病毒假病毒体外感染树鼩原代肝细胞模型的建立

目的：建立乙型肝炎病毒假病毒（HBVpp）体外感染树鼩原代肝细胞（PTH）模型。方法：通过肝脏原位两步灌注法分离PTH并对其冻存方法进行优化,通过共转染293T细胞生产基于慢病毒包装系统的HBVpp并考察其感染的种属和组织特异性。结果：通过肝脏原位两步灌注法分离了PTH,并优化了PTH冻存液的配方;包装的HBVpp具有与HBV真病毒类似的感染种属和组织特异性。结论：该模型的建立对深化HBV进入肝细胞机制的研究具有重要意义。     

生物芯片技术及其在病原微生物检测方面的进展

生物芯片 ( biochip)是二十世纪 90年代中期发展起来的一项尖端技术 [1 ] 。它以玻片、硅为载体 ,在单位面积上高密度地排列大量的生物材料 ,从而达到一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的。基因芯片、蛋白芯片等都属于生物芯片的范畴。生物芯片根据芯片上的探针不同 ,可分为蛋白芯片和基因芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白 ,则称为肽芯片或蛋白芯片。如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或靶 DNA,则称为基因芯片。生物芯片是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。生物芯片能为现代医学科学及医学诊断…