利用Gateway技术构建慢病毒载体及其在鸡囊胚细胞中的表达

目的:建立慢病毒载体介导的外源基因在动物中表达的模式。方法:通过PCR扩增出带EGFP基因和特异性结合位点的DNA序列,并应用Gateway技术构建了带EGFP基因的pLenti6/v5-DEST慢病毒载体。利用磷酸钙介导慢病毒4质粒系统在包装细胞中转染,收集并浓缩产生的病毒颗粒,通过感染293FT细胞测定慢病毒滴度。结果:通过PCR扩增后测序分析,表明慢病毒载体构建正确。病毒滴度测定结果为2×107TU/mL。并用慢病毒对鸡囊胚细胞进行感染,获得了较强的表达效果。结论:慢病毒载体系统所产生的病毒颗粒对动物细胞具有较强的感染能力,为慢病毒载体在转基因家禽研究中的应用奠定了基础。     

家禽的性别鉴定方法

现代家禽生产,祖代鸡通过释肛鉴定性别,父母代鸡以羽速（快慢羽）判定公母,而商品代鸡则以羽色自别雌雄。常规性别鉴定方法耗资费力,且慢羽基因（K）与内源病毒基因（ev-21）紧密连锁,导致慢羽鸡群免疫反应降低,成活率和产蛋性能下降。以鉴定W染色体上性连锁DNA序列或基因为基础,从分子水平上鉴定家禽性别的研究有望填补家禽性别鉴定空白。     

以黑丝羽乌骨鸡为供体制作家鸡嵌合体的研究

以黑丝羽乌骨鸡（BS）为供体,自来航鸡（WL）为受体,进行了BCs嵌合体制作技术研究。结果表明：（1）“黑羽”对“白羽”、“丝羽”对“片羽”为完全隐性,可以在供体与嵌合体测交中,后代是否出现这些特征作为种系嵌合体判断依据。（2）供体的其它表型,对受体属于完全或不完全显性,可以作为体细胞嵌合体判断依据。（3）通过改进嵌合体制作技术,嵌合体雏鸡的出壳率为40％（29／73）,其中据羽色判断的嵌合体率为18％（13／73）;以黑羽为依据选择体细胞嵌合体雏鸡,10只饲养至720d,其中60％（6／10）的嵌合体外观基本不变（其余的换羽后褪去黑羽）;嵌合体鸡与供体测交,以黑羽、灰羽和丝羽判断,8只嵌合体鸡的种系传递率分别为2．5％-71．4％、5．5％～14．3％以及1．7％～10．5％。首次利用BS鸡资源,建立了多表现型嵌合体模型,为家鸡嵌合体技术深入研究提供了方便的检测方法。     

手持密度仪检测鸡与鸭精子密度技术的研究

精子密度仪在哺乳动物中已推广应用,但在家禽中还研究很少。本文以黑凤鸡和攸县麻鸭精液为实验材料,手持精子密度仪与血细胞计数板为检测工具,对影响精子密度测定方法准确率因素进行分析,建立鸡、鸭精子密度-吸光度函数并进行验证。结果表明:用密度仪测定时的稀释液(简称"测试液")为3%NaCl时,精液稀释后应尽快检测吸光度;样液在比色皿中的混匀方式对吸光度测定有很大影响;精液用3%NaCl以及3种常用家禽精液稀释液进行10倍稀释后测定吸光度,B液吸光度显著高于与其它3组(P<0.05),其它3组间差异不显著(P>0.05)。用测试液为3.0%NaCl,鸡和鸭精子密度-吸光度呈三次函数关系,回归方程分别是Y_1=1.374X^3-0.786X^2+0.945X-0.002(R^2=0.997)、Y_2=1.283X^3-0.899X^2+0.994X-0.009(R^2=0.996);用0.9%NaCl代替3%NaCl作测试液简化精子密度测定方法可行,鸡精子密度-吸光度回归方程为Y_3=-0.264X^3+1.23X^2+0.468X+0.019(R^2=0.999)。鸡精液测试液为0.9%NaCl、3%NaCl时两种函数的吸光度最佳范围分别是0.035～0.692、0.069～0.624,在此范围内计数板与方程两种方法得到的密度差异不显著(P>0.05),以计数法为真实值,两种方法平均相对误差分别为6.95%、3.11%。以3%NaCl为测试液,鸭精液函数所测样品吸光度最佳范围小于鸡精液的,以计数板法为真实值,在吸光度0.054～0.123范围内的,函数与计数板两种方法所得的精子密度的平均相对误差为4.61%。本文将促进家禽手持精子密度仪研发,以及更好的使用哺乳动物精子密度仪。     

鸡蛋开窗法导入供体胚盘细胞对家鸡胚胎发育的影响研究

通过4批孵化实验,研究鸡蛋开窗法注射供体胚盘细胞对受体鸡胚发育及孵化率的影响。GLM方差分析表明,开窗处理极显著降低整个孵化期（21d)的活胚比例（P＜0．01）,至21日龄出壳时,处理组的孵化率为.8%-6.0%。导入供体胚盘细胞对受体鸡胚的发育仅为阶段性影响,表现在显著性孵化第8日龄左右的活胚比例（P＜0.05)。而对后期发育的影响不显著（P＞0．05）。因经,鸡蛋开窗处理是降低受体胚胎成活率和孵化率的主要原因,如何降低开窗处理对受体胚胎的应激和不利影响则是今后研究的一个课题。     

种蛋开窗技术及其对鸡胚发育影响的研究

种蛋开窗对禽胚实施操作的技术在转基因禽类、利用多能细胞保存禽类种质资源以及禽胚实验模型等领域的研究具有重要价值。以家鸡新产蛋(含有禽胚胎干细胞)为材料,研究出了种蛋开窗切块自动复位技术,并在此基础上以接近禽胚实施操作为目的,进行了不同封口方法、不同开窗位置和添加液体排除因开窗形成的空气泡等对种蛋孵化率影响的实验。结果表明:种蛋赤道面开窗不同封口方式对孵化率影响的差异不显著,最高孵化率可达到65%;赤道面开窗,通过添加液体排除空气泡的影响不会提高孵化率,空气泡的大小与孵化率没有明显相关性;种蛋气室端开窗(针刺透内壳膜操作胚胎)方式,比赤道面开窗方式的孵化率明显提高,两种方法能见胚率均在90%以上;采用以上技术对种蛋开窗、找胚和封口,制作效率在每人每小时30个以上。本文系统地研究和报道了种蛋开窗操作禽胚简单而实用的技术,有助于解决目前种蛋开窗技术复杂且孵化率低的困境。     

家禽的性别鉴定方法

现代家禽生产,祖代鸡通过翻肛鉴定性别,父母代鸡以羽速(快慢羽)判定公母,而商品代鸡则以羽色自别雌雄.常规性别鉴定方法耗资费力, 且慢羽基因(K)与内源病毒基因(ev-21)紧密连锁,导致慢羽鸡群免疫反应降低,成活率和产蛋性能下降.以鉴定W染色体上性连锁DNA序列或基因为基础,从分子水平上鉴定家禽性别的研究有望填补家禽性别鉴定空白.     

60Co-γ射线对食用蛋保鲜和种蛋胚胎发育致弱作用的研究

采用60Co辐射源,研究不同剂量对食用蛋的灭菌和保鲜效果,以及对种蛋囊胚的致弱作用。结果表明:7 kGy的辐照剂量可以杀灭鸡蛋内容物和蛋壳上的全部细菌,但即使是4 kGy,对鸡蛋的保鲜和延长货架期方面起到的也是副作用;从3 Gy~11 Gy剂量范围内对种蛋进行辐照,其对应的孵化率为71.8%~13.3%。由于没有一个衡量辐照致弱种蛋胚胎发育程度的参数,提出了相对于空白组的孵化率下降幅度作为家鸡囊胚细胞嵌合体选取辐照剂量的依据。     

鸡胚部分去壳离体培养的效果与发育观察

将２５枚产后不到２４ｈ的种蛋,依次用碘酒和７０％酒精擦拭消毒处理,去掉其钝端外壳三分之一,然后用保鲜膜封口,并以２５枚正常种蛋作为对照,按常规方法进行孵化。重复实验３次。第１次孵化,实验组的孵化率显著低于对照组（Ｐ〈０．０５）,仅为４％;第２次孵化,两组的孵化率比较接近（分别为７２％和８０％）;第３次孵化,实验组的孵化率（７６％）稍低于对照组（８８％）。３次孵化的平均孵化率,实验组和对照组分别为６     

以精子为载体的体外转基因猪胚胎研究

去精清精子与外源DNA共孵育,使其携带外源DNA,再与成熟卵母细胞进行体外受精,生产转基因猪胚胎,为通过胚胎移植生产转基因猪奠定基础。结果:通过PCR从不同时期胚胎中检测出携带外源DNA的阳性胚,说明精子与外源DNA共孵育能使精子携带外源DNA,并通过体外受精技术使外源DNA进入早期胚胎。