人促红细胞生成素基因和GFP共表达的输卵管特异性表达载体的构建

本实验从蛋鸡输卵管基因组DNA中扩增出约1.3kb的卵清蛋白5＇端调控区（OV）,并从质粒扩增出人促红细胞生成素（hEPO）基因组DNA。将hEPO亚克隆入pEGFP-C1载体的多克隆位点,命名为pEGFP-hEPO,然后将OV片段亚克隆入经Ase I和Vsp I双酶切的切口处,替换掉CMV启动子,经测序和酶切鉴定正确,成功构建了鸡卵清蛋白5＇端调控区调控人促红细胞生成素的共表达载体pOV-GFP-hEPO。并利用脂质体转染法转染鸡输卵管上皮细胞,用荧光倒置显微镜观测绿色荧光蛋白的表达,结果显示共表达载体pOV-GFP-hEPO能够在鸡输卵管上皮细胞定位表达。为制备生产人促红细胞生成素的鸡输卵管生物反应器奠定了基础。     

利用Gateway技术构建慢病毒载体及其在鸡囊胚细胞中的表达

目的:建立慢病毒载体介导的外源基因在动物中表达的模式。方法:通过PCR扩增出带EGFP基因和特异性结合位点的DNA序列,并应用Gateway技术构建了带EGFP基因的pLenti6/v5-DEST慢病毒载体。利用磷酸钙介导慢病毒4质粒系统在包装细胞中转染,收集并浓缩产生的病毒颗粒,通过感染293FT细胞测定慢病毒滴度。结果:通过PCR扩增后测序分析,表明慢病毒载体构建正确。病毒滴度测定结果为2×107TU/mL。并用慢病毒对鸡囊胚细胞进行感染,获得了较强的表达效果。结论:慢病毒载体系统所产生的病毒颗粒对动物细胞具有较强的感染能力,为慢病毒载体在转基因家禽研究中的应用奠定了基础。     

以黑丝羽乌骨鸡为供体制作家鸡嵌合体的研究

以黑丝羽乌骨鸡（BS）为供体,自来航鸡（WL）为受体,进行了BCs嵌合体制作技术研究。结果表明：（1）“黑羽”对“白羽”、“丝羽”对“片羽”为完全隐性,可以在供体与嵌合体测交中,后代是否出现这些特征作为种系嵌合体判断依据。（2）供体的其它表型,对受体属于完全或不完全显性,可以作为体细胞嵌合体判断依据。（3）通过改进嵌合体制作技术,嵌合体雏鸡的出壳率为40％（29／73）,其中据羽色判断的嵌合体率为18％（13／73）;以黑羽为依据选择体细胞嵌合体雏鸡,10只饲养至720d,其中60％（6／10）的嵌合体外观基本不变（其余的换羽后褪去黑羽）;嵌合体鸡与供体测交,以黑羽、灰羽和丝羽判断,8只嵌合体鸡的种系传递率分别为2．5％-71．4％、5．5％～14．3％以及1．7％～10．5％。首次利用BS鸡资源,建立了多表现型嵌合体模型,为家鸡嵌合体技术深入研究提供了方便的检测方法。     

种蛋开窗技术及其对鸡胚发育影响的研究

种蛋开窗对禽胚实施操作的技术在转基因禽类、利用多能细胞保存禽类种质资源以及禽胚实验模型等领域的研究具有重要价值。以家鸡新产蛋(含有禽胚胎干细胞)为材料,研究出了种蛋开窗切块自动复位技术,并在此基础上以接近禽胚实施操作为目的,进行了不同封口方法、不同开窗位置和添加液体排除因开窗形成的空气泡等对种蛋孵化率影响的实验。结果表明:种蛋赤道面开窗不同封口方式对孵化率影响的差异不显著,最高孵化率可达到65%;赤道面开窗,通过添加液体排除空气泡的影响不会提高孵化率,空气泡的大小与孵化率没有明显相关性;种蛋气室端开窗(针刺透内壳膜操作胚胎)方式,比赤道面开窗方式的孵化率明显提高,两种方法能见胚率均在90%以上;采用以上技术对种蛋开窗、找胚和封口,制作效率在每人每小时30个以上。本文系统地研究和报道了种蛋开窗操作禽胚简单而实用的技术,有助于解决目前种蛋开窗技术复杂且孵化率低的困境。     

以精子为载体的体外转基因猪胚胎研究

去精清精子与外源DNA共孵育,使其携带外源DNA,再与成熟卵母细胞进行体外受精,生产转基因猪胚胎,为通过胚胎移植生产转基因猪奠定基础。结果:通过PCR从不同时期胚胎中检测出携带外源DNA的阳性胚,说明精子与外源DNA共孵育能使精子携带外源DNA,并通过体外受精技术使外源DNA进入早期胚胎。     

南方中国荷斯坦牛耐热性的数量遗传学研究

本研究采用公畜内半同胞相关法,分别从产奶量（350头）、耐热产奶量（116头）、直肠温度（200头）和红细胞钾（144头）四个方面估算奶牛群体遗传力,结果分别是0．334、0．196、0．20、0．318．利用SAS8．1版本对数据进行二元回归分析,得到回归方程：y=0．23853-0．0096xa＋0．000827x2（x1为直肠温度,x2为红细胞钾含量）．运用BLUP法估算公牛育种值,以色列公牛育种值最高,为85．12．     

慢病毒载体导入种蛋内鸡胚技术研究

种蛋内鸡胚含有潜在的胚胎干细胞(BCs)或原生殖细胞(PGCs),是目前主要的转基因鸡研究方法。采用绿色荧光蛋白(GFP)基因的pLenti6/v5-DEST-GFP慢病毒表达载体,白来航鸡与伊萨鸡种蛋,结合种蛋赤道面开窗专利技术,对含这两种细胞胚的转基因技术进行了比较研究:转染白来航鸡囊胚,孵化13天时,GFP基因的PCR检出率为64.7%,孵化率极低;转染孵化72h伊萨鸡胚血液循环中PGCs,实验蛋孵化率为35.0%,在出壳后死亡的3只小鸡肝脏中,GFP基因的PCR检出率为100%,存活的4只鸡中有3只在12月龄的血液样品中,经PCR扩增出了GFP基因;转染孵化72～79h白来航鸡胚PGCs,7批次实验的平均孵化率为21.1%,能在赤道面窗口注射胚的种蛋比率,以73～77h胚龄的最高,为75.0%～92.9%,注射病毒组出壳雏鸡血液DNA中,GFP基因PCR检出率为44.4%。两种方法比较,PGCs方法在实验蛋孵化率、胚定位在赤道面窗口率等方面有较强优势。因此为种蛋内胚细胞的转基因鸡技术研究提供了系统、可操作性强的方法。     

论湖南地方畜禽种质资源冷冻保存库的建立

地方畜禽品种资源保护与利用越来越受到国家相关部门的重视,湖南作为一个农业大省,也拟订了地方畜禽品种资源保护初步规划.主要简述了畜禽遗传资源保存的相关概念,冷冻保存的优势,国家的相关政策以及湖南畜禽品种资源保护工作的现状,并对湖南未来畜禽品种资源保护与利用工作思路进行了探讨.