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CRISPR/Cas9技术是新近发展起来的对细胞和动物模型进行基因编辑的重要方法。本文利用DNA双链断裂(Double-strand breaks, DSBs)引起的同源重组(Homologous recombination, HR)依赖与非依赖的修复机制,建立基于CRISPR/Cas9核酸酶技术构建定点突变小鼠品系的技术体系。针对赖氨酸特异脱甲基化酶2b(Lysine (K)-specific demethylase 2b, Kdm2b)酶活关键位点对应的基因组DNA序列设计单一导向RNA(Single-guide RNA, sgRNA),通过与Cas9 mRNA共显微注射,分别得到Kdm2b基因发生移码突变的基因失活品系及关键位点氨基酸缺失的酶活突变型小鼠品系。此外,利用HR介导的修复机理,将黄素单加氧酶3(Flavin containing monooxygenases3, Fmo3)基因的sgRNA序列及对应的点突变单链寡脱氧核苷(Single strand oligonucleotides, ssODN)修复模板共注射到小鼠受精卵雄原核。对F0小鼠基因测序分析显示,成功构建了Fmo3基因移码突变的基因敲除和单碱基定点突变的基因敲入小鼠,这些突变能够稳定遗传给子代。本研究利用CRISPR/Cas9技术,通过同源重组依赖与非依赖两种DNA损伤修复方式,成功构建了特定位点突变的小鼠品系。 相似文献
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蜂毒溶血肽前体蛋白cDNA的克隆及其融合蛋白的表达 总被引:8,自引:0,他引:8
从蜜蜂毒腺中提取总RNA ,通过RT PCR扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的cDNA ,将扩增产物克隆到 pT7Blu T载体上 ,再进一步将插入片段酶切并连接到 pUC1 1 8载体上 ,构建了重组质粒pUMP。DNA序列分析结果表明 ,克隆得到的cDNA序列与所发表序列完全相同 ,且与 β 半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框。含重组质粒 pUMP的大肠杆菌DH5α表达了与β 半乳糖苷酶部分序列融合的蜂毒溶血肽前体蛋白 相似文献
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利用Red重组系统快速构建基因打靶载体 总被引:1,自引:0,他引:1
基因敲除小鼠模型是在哺乳动物体内研究基因功能最可靠的方法之一。利用常规的分子克隆的方法构建基因打靶载体往往工作周期长,对于难度特别大的基因有时甚至无法完成打靶载体的构建。通过合理应用Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆了长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了Gpr56等基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,实现了打靶载体的快速构建。 相似文献
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用绵羊和牛的Cx44基因(connexin 44 protein gene)序列对NCBI数据库进行Blast检索,得到一个相似性很高的人DNA序列(Human Genome Bank:AL138688),用GENSCAN程序分析AL138688,推测AL138688中包含一个编码区由1个外显子构成的基因——Cx44基因。人Cx44基因的开放阅读框为1320bp,推测编码435个氨基酸。用PROMOTORSCAN程序分析了其启动子。人Cx44基因与绵羊Cx44基因在1320bp有84.75%的一致性,其表达的蛋白有83%的一致性。用Map View将人的Cx44基因定位于13号染色体。 相似文献
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