胚胎体外共培养：影响因素及作用机理

综述了近年来关于哺乳动物早期胚胎与体细胞共培养的研究进展。重点讨论了早期胚胎与不同类型体细胞共培养,血清、发情周期和体细胞传代次数对胚胎共培养效果的影响,以及胚胎体外共培养的作用机理。体细胞共培养体系可以改善早期胚胎体外培养的条件,促进胚胎发育,提高着床率和妊娠率,在发育生殖研究领域有着广泛的应用前景。然而,对其影响因素和作用机理尚欠系统深入研究,许多问题还亟待解决。     

应用乙二醇冷冻小鼠胚胎：优化和简化程序的探索

提高解冻胚胎的发育能力和简化冷冻解冻程序是胚胎冷冻研究的两大永恒的主题。尽管乙二醇（EG）广泛用于家畜胚胎冷冻,但很少用于冷冻小鼠和人胚胎。为数很少的以EG慢冻小鼠或人胚胎的研究均采用较为复杂的人胚冷冻程序,未见简化程序和用EG冷冻小鼠桑椹胚的报道。采用简单的牛胚胎冷冻程序研究了发育时期、EG浓度、平衡方法、添加蔗糖以及解冻后脱除EG等对小鼠胚胎冻后发育能力的影响。结果显示：（1）致密晚期桑椹胚冻后体外培养囊胚发育率（81.92%±2.24%）和孵出率（68.56％±2.43%）显著（P＜0.05)高于4-细胞、8-细胞胚胎和致密早期桑椹胚胎;（2）1.8mol/L EG冷冻小鼠致密晚期桑椹胚的囊胚发育和孵出率显著高于其它浓度;（3）在EG中平衡10min的冻后囊胚发育显著好于平衡5、20或30min;（4）两步平衡冷冻胚胎的囊胚发育率和孵出率显著高于一步平衡;（5）用EG冷冻小鼠胚胎无需添加蔗糖;（6）解冻后可不脱除EG;（7）冻后发育的早期囊胚和囊胚细胞数明显少于体内发育胚胎。因此,用EG冷冻小鼠胚胎的最佳方案为：致密晚期桑椹胚用1.8mol/L EG不添加蔗糖、两步平衡15min、以简单的牛胚胎冷冻程序冷冻解冻、解冻后不脱除EG直接培养或移植。     

烹饪前后红烧肉的营养评价及其营养成分变化

目的：系统评估红烧肉成品菜肴的营养价值并研究烹饪对其营养的影响。方法：通过测定生原料和成品中蛋白质、脂肪、矿物质和维生素、氨基酸、脂肪酸等26种营养素的含量并加以分析。结果：烹饪后的成品相较于生原料,蛋白质、碳水化合物、灰分、磷、铁、镁、硒含量显著上升,能量、脂肪、总膳食纤维含量显著下降（P<0.05）;在含量占比方面,苯丙氨酸、丝氨酸、呈味氨基酸、单不饱和脂肪酸显著上升,亮氨酸、精氨酸、多不饱和脂肪酸显著下降（P<0.05）;此外,水溶性维生素B1和维生素B12烹饪后可保留74.51%和41.70%,第一限制氨基酸在烹饪前后均为苯丙氨酸＋酪氨酸保持不变。结论：红烧肉烹调后蛋白质和矿物质含量增加,维生素B1保留率较高。     

肝素处理山羊精子体外获能的研究

系统研究了作用浓度、时间和温度以及输卵管上皮细胞和卵丘细胞对肝素处理山羊精子体外获能后的精子活力、质膜完整性、顶体完整率、获能比例及受精和卵裂的影响,为改善山羊精子体外获能效果和研究获能机理提供了必要的数据。主要实验结果如下：1、在获能液中添加5、10、25、50和100μg/mL肝素处理45min时,添加50和100μg/mL肝素精子获能比率最高（分别为55%和56%）,但添加100μg/mL肝素处理后顶体完整率明显（P<0.05）低于对照组。说明山羊精子获能的最佳肝素浓度为50μg/mL。2、肝素作用时间（0, 10, 20, 30, 45, 60 和120 min）的延长,获能精子比例逐渐提高。其中,肝素处理45～120 min各组的获能精子比例差异不显著（P>0.05）,处理120 min组的精子活力和质膜完整率显著低于其它各组。说明50μg/mL肝素处理精子获能的最佳时间是45～60 min。3、在42℃和38.5℃下处理时,获能精子比例显著高于15℃和37℃,但42℃处理后精子活力和顶体完整率显著低于其它温度。因此,385℃为山羊精子获能的最佳温度。4、与输卵管上皮细胞共培养获能精子比例显著高于对照组和卵丘细胞组,但精子活力、质膜完整率和顶体完整率差异不显著。输卵管上皮组的受精率（91.3％）和卵裂率（72.2％）显著高于对照组（81.2％,65.0％）。说明与输卵管上皮细胞共培养能显著提高肝素处理山羊精子体外获能的效果。     

乙醇及6-DMAP对小鼠卵母细胞孤雌激活的研究

实验研究了乙醇、6-DMAP以及二者联合使用时对注射hCG后18小时采集的小鼠卵母细胞孤雌激活的效果。结果证明:(1)用5％的乙醇分别作用5和10分钟及10％的乙醇分别作用5和10分钟,小鼠卵母细胞的孤雌激活率分别为41.3％、63.7％、57.9％和85.6％。说明在一定范围内,随着乙醇浓度和作用时间的增加,小鼠卵母细胞孤雌激活率有上升的趋势。(2)用2mM 6-DMAP作用2、4和6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率分别为 12.0％、25.0％和40.0％。说明随着6-DMAP作用时间的增加,小鼠卵母细胞的孤雌激活率有所升高。(3)用5％乙醇作用5分钟,再用含有2mmol/L 6-DMAP的培养液培养6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率可达65.5％,明显高于单独使用5％乙醇作用5分钟或单独使用2mmol/L 6-DMAP作用6小时卵母细胞的孤雌激活率。(4)用10％的乙醇作用5分钟,再用含有2mmol/L 6-DMAP的培养液培养6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率达到100％,远远高于单独使用10％乙醇作用5分钟或单独使用2mmol/L 6-DMAP作用6小时卵母细胞的孤雌激活率。(5)在单独使用乙醇刺激时,激活卵母细胞中直接卵裂(2-细胞)的比率随乙醇作用强度的增加而增加,最高达62.5％;但6-DMAP则抑制激活卵母细胞的直接卵裂,增加二原核卵的比例。     

去乙酰化酶1基因对牛前体脂肪细胞凋亡影响的研究

去乙酰化酶1(sirtuin type1,SIRTl)是一个新的脂肪细胞调控因子,通过与其靶基因叉头转录因子1(the forkhead box O family1,FoxO1)相互作用,参与细胞增殖、分化、衰老、凋亡和代谢过程.利用吖啶橙(acridine orange,AO)染色、流式细胞仪、荧光定量PCR(quantitative real-timePCR,qPCR)等技术方法,研究SIRT1的抑制剂———烟酸胺(nicotinamide,NAM)处理后对鲁西黄牛皮下前体脂肪细胞(bovine subcutaneous preadipocytes,BSP)和肌内前体脂肪细胞(bovine intramuscular preadipocytes,BIP)凋亡的影响.观察了BSP和BIP的凋亡形态;比较了SIRT1基因抑制后,相关基因如FoxO1等在两种细胞之间的表达差异.结果表明,NAM对BSP和BIP细胞表现出相同的生长抑制作用,处理组的BSP和BIP细胞的凋亡率均显著高于对照组,其作用可能通过抑制SIRT1,激活FoxO1凋亡通路实现.SIRT1及其相关基因对BSP和BIP的调控存在不同途径.     

牛卵母细胞玻璃化冷冻保存影响因素的研究

采用毛细玻璃管法对牛卵母细胞进行玻璃化冷冻保存,解冻后再进行体外受精（IVF）和早期胚胎的体外培养（IVC）。在此技术的基础上,分别对冷冻前平衡时间、解冻处理、卵丘细胞层数以及卵母细胞所处的减数分裂阶段等影响卵母细胞冷冻保存的因素进行研究,以期筛选出适合牛卵母细胞冷冻保存的方法。结果发现,处于MⅡ期卵母细胞在10％二甲基亚砜（DMSO）＋10％乙二醇（EG）液（VSl）中平衡1～3min,然后进行玻璃化冷冻保存。解冻时将卵母细胞先移入VS1液中处理15s,然后移入蔗糖稀释液中。另外发现,冷冻保存时部分卵丘细胞对卵母细胞有保护作用。而减数分裂阶段不影响解冻后卵母细胞形态正常率,但对胚胎发育率有严重影响。     

山羊卵母细胞的减数分裂进程

本实验以随机屠宰山羊的卵巢为实验材料,研究了不同直径卵泡卵母细胞的减数分裂进程。结果显示,不同直径卵泡卵母细胞在体外成熟培养条件下的减数分裂能力不同:≤0.5mm直径卵泡的卵母细胞不能恢复减数分裂;0.8-1.2mm卵泡的卵母细胞可恢复减数分裂,但只能发育到MⅠ期,培养24h发育到MⅠ期比率60%;1.5-5.0mm卵泡卵母细胞已经完全获得减数分裂能力,培养24h发育到MⅡ的比例91%。完全获得减数分裂能力的1.5-5.0mm卵泡卵母细胞处于生发泡(GV)期的比率在成熟培养2-8h期间明显下降;其中,4-6h期间GⅤ比率下降最为迅速(由61%降低到19%,p<0.0005);体外培养6-12h期间MⅠ比率由25%上升到60%,随后下降,到24h仅有2%卵母细胞处于MⅠ期;培养16h有21%卵母细胞进入MⅡ期,24h 91%卵母细胞到达MⅡ期。对卵母细胞体外核成熟进程的数据做折线图计算结果表明,1.5-5.0mm卵泡卵母细胞减数分裂进程(各细胞周期事件出现和维持的时间)为:0-3.0h为GⅤ期,3.0-7.0h为前中期Ⅰ,7.0-14.6h为MⅠ期,14.6-18.4h处于后期-Ⅰ和末期-Ⅰ,18.4-24h为MⅡ期。本实验还证明,部分获得减数分裂能力(0.8-1.2mm卵泡)与完全获得减数分裂能力(1.5-5mm卵泡)的卵母细胞,其各细胞周期事件一旦发生,所需的时间是相同的。这些结果为进一步研究山羊卵母细胞减数分裂机制及其调控提供了重要的基础数据。     

影响小鼠体细胞脂质体法转染效率的因素

本实验主要研究脂质体量、质粒量、细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间、细胞传代次数以及细胞种类对转基因效率的影响。首先研究了脂质体量、质粒量和细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间对小鼠胎儿成纤维细胞(MFFC)的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。结果表明,在本实验条件下,用传至3代的MFFC,24孔培养板中每孔接种4-10×10~4个细胞,70%-90%贴满程度,当脂质体(LipofectAMINE)4μg、质粒(pEGFP-N1)0.3μg,复合物作用时间为6h时获得的转染效率最高, 为30.7%。用此方案比较不同传代次数的MFFC转染效率结果表明,原代细胞的转染效率为10.0%, 3代为28.9%,到15代降到7.2%。说明随着传代次数的增加,转染效率逐渐降低。将MFFC、小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和小鼠颗粒细胞(MGC)分别传至3代,采用上述方案进行转染,转染效率分别是27.8%、13.7%和14.2%。可见不同种类细胞的转染效率不同。细胞周期检测表明,无论是不同代次的细胞还是不同种类的细胞,其转染效率高低与M期所占比例的多少有关。这为如何提高转染效率提供了有利的依据。     

鼠猪异种细胞核移植

核质关系是细胞生物学和发育生物学研究的核心问题之一。细胞核移植技术是研究发育中核质关系的重要手段。尽管最近哺乳动物的细胞核移植取得了重大突破 (Ｗｉｌｍｕｔ等 ,1997;Ｗａｋａｙａｍａ等 ,1998) ,但这些成功实验是在种内进行的 ,而异种间核移植的研究报道较少 (ＭｃＧｒａｔｈ等 ,1986 ;Ｗｏｌｆｅ等 ,1992 ;梅祺等 ,1993)。最近 ,陈大元等( 1999)报道将大熊猫的子宫上皮细胞、骨骼肌细胞和乳腺上皮细胞的细胞核移入去核的兔卵母细胞后 ,分别有9 9%、6 8%和 11 7%的重构卵发育到囊胚。Ｄｏｍｉｎｋｏ等( 1999)把绵羊、猪、猴或大…